Постановка проблемы (Introduction)Яровая пшеница в Казахстане является основной экспортной культурой и выращивается на площади примерно 14,3 млн га, из которых более 80 % сосредоточены в северном регионе [1]. Климатические условия Северного Казахстана являются благоприятными для выращивания большинства яровых зерновых культур, однако особенностью данного региона является нестабильность урожайности, что обусловлено не только агрометеорологическими факторами, но и воздействием вредных микроорганизмов. Поражение пшеницы фитопатогенными грибами приводит к значительным потерям урожая, ухудшению его качества. Среди болезней пшеницы следует выделить альтернариоз, фузариоз и гельминтоспориоз, поскольку грибы, их вызывающие, заселяют поверхность зерна, проникают в зародышевую зону, а также поражают прикорневую зону стеблей пшеницы, что в последствие приводит к снижению качества и урожайности этой культуры. В последнее время наиболее часто из зародышевой зоны семян пшеницы выделяются микромицеты рода Alternaria, которые являются уже доминантным компонентом микробиома зерна [2, с. 11]. Виды этого рода широко распространены, встречаются как сапрофиты на растительных остатках, а также как патогены различных видов растений [3, с. 93]. Некоторые виды являются возбудителями болезней агрономически и экономически важных растений, а также являются опасными послеуборочными патогенами [4, с. 129], [5, с. 225]. Грибы Alternaria распространены на семенах злаковых культур, проникая внутрь семян, локализуются в эндосперме и плодовых оболочках, инфицируют зародыши, вызывая симптомы болезни «черный зародыш». Кроме того, могут снижать продуктивность растений, и ухудшать качество продуктов из зерна. Ухудшение качества зерна, вызванное способностью грибов рода Alternaria продуцировать микотоксины, в настоящее время активно исследуется, в ряде работ показано, что некоторые из метаболитов могут обладать канцерогенными и аллергенными свойствами [6, с. 181], [7, с. 1004].Схожесть морфологических критериев и симптомов болезней у различных видов растений затрудняют видовую идентификацию рода Alternaria [8, с. 1], [9, с. 34]. В этой связи возникает необходимость использования разнообразных подходов (биохимических, молекулярно-генетических, морфологических) для выявления генетического полиморфизма и установления таксономической принадлежности [10, с. 123]. Популяции грибов этого рода характеризуются значительным генетическим разнообразием, что связано со способностью конидий к миграции на большие расстояния, а также воздействием антропогенных факторов [11, с. 5].Исследования генетического полиморфизма популяций и эволюционных взаимодействий проводят с использованием различных подходов, наиболее часто исследуют полиморфизм внутренних и межгенных транскрибируемых спейсеров (ITS, IGS) рибосомальной области ДНК [12, с. 62], [13, с. 1]. Для изучения аспектов таксономии и эволюционных взаимодействий этих фитопатогенных грибов используют различные ДНК-технологии, такие как RAPD, AFLP, ISSR и SSR, а также секвенируя ДНК- и белок-кодирующие регионы [9, с. 34], [14, с. 1], [15, с. 95]. В дополнение к этим маркерам изучение вариабельности последовательностей ретротранспозонов может расширить знания о филогенетических взаимоотношениях внутри популяций фитопатогенных грибов.Ретротранспозоны – потенциально мобильные элементы, распространены по всему геному, участвуют в мейотических рекомбинациях, вызывая его нестабильность вследствие инверсий и транслокаций [16, с. 1], [17, с. 483]. Как и в растительном геноме, активация ретротранспозонов способствует повышению генетической пластичности в ответ на экологический стресс, у грибов их активация способствует более быстрой эволюции [18, с. 53], [19, с. 1]. Несмотря на то что геном грибов значительно меньше в сравнении с растениями разработка молекулярных маркеров на основе ретротранспозонов затруднительна. Метод iPBS (Inter-Primer Binding Site Polymorphism), разработанный R. Kalendar с соавторами, позволяет преодолеть эту проблему, используя консервативные области последовательностей PBS (Primer Binding Site) сайтов ретротранспозонов как для выявления полиморфизма в профилях транскрипции, так и для поиска в базах данных ретротранспозонов [20, с. 1419]. Высококонсервативный PBS-регион характерен для различных семейств LTR ретротранспозонов [21, с. 233]. Данный метод является универсальным и эффективным для непосредственного выявления полиморфизма между индивидуумами, поэтому универсальные PBS-праймеры могут быть использованы практически у любых организмов, в том числе и у грибов [22, с. 128]. Несмотря на очевидные преимущества iPBS-метода, использование его для исследования генетического разнообразия грибов было очень ограниченным: только несколько видов Alternaria были исследованы, хотя зерно пшеницы может быть контаминировано несколькими видами одновременно [23, с. 479], [24, с. 225], [25, с. 307], [26, с. 76]. В данной работе мы использовали iPBS-метод для выявления генетического полиморфизма фитопатогенных грибов рода Alternaria, выделенных нами из зародышевой зоны семян пшеницы Казахстана.Методология и методы исследования (Methods)Выделение фитопатогенных грибов рода Alternaria проводили с использованием стандартных микробиологических методов, основанных на стимуляции роста и развития патогенов в лабораторных условиях [27, с. 20]. Долю конкретного вида (%) определяли, как отношение числа зерен, зараженных определенным видом к числу зерен, зараженных любыми видами этого рода.Изоляты выращивали в чашках Петри на питательных средах при 25 °С в течение 7–15 дней. Микроскопический анализ грибов осуществляли на 7–15 сутки с использованием микроскопов Micros-200 (Austria) с фотонасадкой SSD, видеокамерой Hi-Resolution SD66P. Морфологические признаки изучаемых видов сравнивали со стандартными характеристиками из определительной литературы или с материалом, представленным на сайте http://www.mycobank.org [28, с. 28]. При этом учитывали такие признаки, как тип ветвления конидий, характеристика поверхности спор, их размер и др.Выделение ДНК из фитопатогенных грибов проводили СТАВ-методом с собственными модификациями [29, с. 98], [30, с. 1]. Экстракцию геномной ДНК осуществляли из мицелия (50 мг) с использованием модифицированного экстракционного буфера CTAB с РНКазой А (http://primerdigital.com/dna). Генетическую идентификацию изолятов Alternaria spp. проводили методом ПЦР с использованием прямых праймеров ITS1 (5′ ggaagtaaaagtcgtaacaagg 3′) и ITS4 (5′ tcctccgcttattgatatgc 3′). Температурно-временные параметры амплификации для праймеров включали предварительную денатурацию при 95 °С в течение 2 минут, затем 32 цикла: 95 °С – 10 с, 50 °C – 30 с, 72 °С – 60 с, 72 °С – 3 мин.Генетическую изменчивость изолятов Alternaria spp. оценивали с использованием PBS-праймеров, разработанных R. Kalendar с соавторами [21, с. 233]. ПЦР-амплификацию проводили при следующих условиях: денатурация при 98 °С – 1 минута, затем 30 циклов в режиме 98 °С – 5 с, отжиг при 50–60 °С (в зависимости от праймера) – 20 с, элонгация при 72 °С – 60 с с последующей элонгацией при 72 °С – 3 мин. Каждую реакцию амплификации повторяли дважды на каждом образце ДНК.Продукты ПЦР разделяли электрофорезом при 70 В в течение 6 ч в 1,5-процентном агарозном геле. Визуализацию продуктов амплификации проводили с использованием гельдокументирующих систем ChemiDoc-It2 и PharosFX Plus с разрешением 50 мкм после окрашивания бромидом этидия. Анализ спектров амплификации проводили с использованием программного обеспечения GenAlex 6.5 [31, с. 2537]. Результаты (Results)Исследования по выделению фитопатогенных грибов пшеницы были проведены в 2018–2019 гг. совместно с сотрудниками лаборатории микробиологии научно-производственного Центра зернового хозяйства им. А. И. Бараева. Были исследованы семена пшеницы различных сортов, районированных в Павлодарской, Актюбинской, Карагандинской, Акмолинской, Северо-Казахстанской областях. У всех обследованных образцов преобладала скрытая форма заражения зерновок (внешне здоровые, всхожие, имели нормальный блеск, налет гриба отсутствовал); но иногда наблюдалась и явная пораженность (формирование налета со спороношением гриба, разная степень деформации зерновок). Микологический анализ выявил присутствие в микобиоте различных видов грибов, относящихся к родам Alternaria, Aspergillus, Bipolaris, Cladosporium, Epicoccum, Fusarium, Penicillium и др. (рис. 1). Рис. 1. Анализ семян пшеницы сорта Карагандинская 22 на наличие патогенной микрофлорыFig.1. Analysis of seeds of the wheat Karagandinskaya 22 for the pathogenic fungiСравнительный анализ родового состава показал, что наиболее часто зародышевая зона семян пшеницы была контаминирована грибами из рода Alternaria, выделяющихся с частотой до 50–77,5 %. Интенсивность поражения грибами из рода Fusarium была незначительной (3,7–10 %). Возбудитель гельминтоспориозной корневой гнили Bipolaris выделялся с частотой 3 %, данный патоген был идентифицирован только в пробах семян из Северо-Казахстанской области.Также были проведены мониторинговые исследования на посевах пшеницы различных сортов в Акмолинской и Карагандинской областях в фазу молочно-восковой спелости. В результате наблюдали интенсивное проявление сапрофитной инфекции, так называемой черни колоса, болезнь проявлялась на зрелых колосьях в виде черного налета. Сильное развитие черни колоса, наблюдаемое на посевах, мы связываем с продолжительной дождливой погодой в период налива зерна и, как следствие, поздней уборкой.Микологический анализ стеблей, колосьев и колосковых чешуй, пораженных чернью, показал, что основными возбудителями, поражающими колосковые чешуи являлись грибы Alternaria spp. (рис. 2). Рис. 2. Микологический анализ растений пшеницы с признаками черни колосаFig. 2. Mycological analysis of wheat plants with black head blight Анализ структуры возбудителей грибных болезней, контаминирующих растения пшеницы в период созревания зерна, выявил сдвиг преобладающих видов: существенную долю составляли грибы Alternaria sp. (до 75 %), также с высокой частотой выделялись представители рода Fusarium sp. (до 35 %). Частота выделения одного из вредоносных возбудителей корневой гнили Bipolaris sp. была незначительной – около 2 %. Также в низком количестве были представлены виды Aspergillus и Penicillium. Исследования выявили доминирующее положение в структуре грибных болезней пшеницы грибов рода Alternaria sp., этот факт побудил нас более детально подойти к их изучению. Выделенные в чистую культуру изоляты Alternaria sp. культивировали на картофельно-декстрозном (PDA) и морковно-декстрозном (МDA) агарах для изучения морфолого-культуральных признаков с целью видовой идентификации. Для возбудителей альтернариоза было характерно формирование цепочек конидий, отличающихся размерами, в легко распадающихся цепочках, разнообразной формы – грушевидных, обратнобуловидных, цилиндрических, яйцевидных. Цвет конидий – от бурых до темно оливковых, имеют 2–4 продольные и 1–2 поперечные перегородки. На основании изученных морфолого-культуральных признаков изоляты грибов Alternaria sp. были отнесены к видам A. alternata, A. tenuissima, A. infectoria (рис. 3). Рис. 3. Микроморфологические особенности грибов рода Alternaria, микроскоп Micros200, увеличение × 600Fig. 3. Micromorphological characteristics of Alternaria sp. Fungi, microscope Micros200, magnification × 600 Для подтверждения видовой принадлежности дополнительно проводили молекулярно-генетическую идентификацию путем секвенирования последовательностей рибосомных генов, которые достаточно широко используются для идентификации филогенетического родства. Несмотря на высокую степень консервативности, нетранскрибирующиеся и транскрибирующиеся спейсерные последовательности ITS-регионов ДНК являются стабильным генетическим маркером, позволяющим надежно идентифицировать до вида эти фитопатогенные грибы. Процент совпадений выделенных образцов Alternaria с последовательностями из GeneBank по числу совпадающих нуклеотидов был довольно высоким и составил 99–100 %. Идентификация показала, что в выделившемся патокомплексе альтернариоза доминируют изоляты А. alternata, частота встречаемости которых составила 53,6 %, изоляты А. infectoria составили 34,1 %, изоляты А. tenuissima выделялись с частотой 12,3 %. Для выявления генетического полиморфизма использовали только идентифицированные изоляты Alternaria с наиболее типичными морфолого-культуральными признаками, выделенными из различных регионов Казахстана. Всего для исследований было использовано 4 изолята А. tenuissima, 7 изолятов А. infectoria и 14 изолятов А. alternata.Предварительно все PBS-праймеры были протестированы для определения их эффективности при детекции полиморфизма в ДНК фингерпринтинге у изолятов рода Alternaria. Эффективность оценивали по количеству амплифицированных фрагментов на 1 образец ДНК. В результате тестирования было выявлено, что только 4 праймера показали наивысшую эффективность в выявлении генетической дифференциации изолятов Alternaria, образуя множество одинаково интенсивных ампликонов. 6 праймеров образовывали от 2 до 4 ампликонов и 15 праймеров обладали средними показателями информативности. В результате тестирования iPBS праймеров для оценки генетического разнообразия изолятов Alternaria, были исключены праймеры, которые генерировали низкое количество продуктов ПЦР. Для дальнейших исследований были использованы праймеры с наивысшим баллом эффективности 2242, 2221 и 2237. Полученные продукты амплификации показали высокую вариабельность среди изолятов, как внутри одного вида, так и на межвидовом уровне. Размер амплифицированных ПЦР-фрагментов был в диапазоне от 200 до 3000 п. н., в среднем наблюдали амплификацию 5–15 бендов на каждый изолят (рис. 4). Рис. 4. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК изолятов Alternaria spp. с iPBS маркером 2237Fig. 4. Electrophoretic analysis of PCR product from isolates Alternaria spp. whith iPBS marker 2237В результате амплификации с iPBS-праймерами (2221, 2237, 2242) было получено 328 фрагментов, 228 из которых были полиморфными. Анализ спектров амплификации показал варьирование уровня полиморфизма у различных видов Alternaria от 47 % до 80 %. Результаты амплификации ДНК изолятов грибов, принадлежащих к различным видам Alternaria, с использованием iPBS-праймеров показали высокую эффективность данного метода. В результате чего данные праймеры были использованы для генетического анализа видов Alternaria (см. таблицу).ТаблицаГенетическое разнообразие видов Alternaria spp. по результатам iPBS фингерпринтаВидКоличество штаммовАмплифицированные фрагментыПолиморфизм, %ВсегоПолиморфныхA. alternata1419816080,81A. infectoria6783747,43A. tenuissima4523159,63Общее2432822861,01 TableGenetic diversity of Alternaria spp. according to iPBS fingerprint SpeciesNumber of strainsAmplified fragmentsPolymorphism, %TotalPolymorphicA. alternata1419816080.81A. infectoria6783747.43A. tenuissima4523159.63Total2432822861.01 В среднем общий уровень детектируемого полиморфизма составил 61 %. Ранжирование штаммов, относящихся к различным видам Alternaria spp., по убыванию показателя PPL выглядит следующим образом A. alternata (80 %) > A. tenuissima (59 %) > A. infectoria (47 %). Обсуждение и выводы (Discussion and Conclusion)Грибные болезни растений, вызывающие значительное снижение урожайности, способны распространяться через семена. Вредоносность микроскопических грибов, контаминирующих семена сельскохозяйственных растений заключается не только в снижении всхожести и энергии прорастания, но и продуцировании микотоксинов, что представляют огромную опасность для млекопитающих. Грибы Alternaria являются доминантным компонентом микробиома зерна во многих регионах мира. Принимая во внимание значительную потенциальную опасность токсигенных видов Alternaria, проблеме изучения этих грибов в последнее время уделяется большое внимание. Следует отметить, что имеется недостаточно сведений о вреде и способах детекции микотоксинов, продуцируемых грибами рода Alternaria. Несмотря на относительно слабую токсичность метаболитов A. tenuissima, A. alternatа для животных в сравнении с фузариотоксинами, вследствие высокой частоты встречаемости этих микромицетов их токсины могут быть опасны для человека, некоторые из них обладают канцерогенным эффектом [6, с. 181]. Грибы рода Alternaria отличаются значительной видовой вариабельностью морфолого-культуральных признаков, зачастую микроморфологические критерии могут сильно варьировать в пределах одного вида. Исследование генетического разнообразия этих патогенов, в том числе и с применением новейших молекулярно-генетических методов, позволит в дальнейшем разработать эффективные методы борьбы с альтернариозом не только на пшенице, но и на других сельскохозяйственных культурах. Оценку биоразнообразия проводят с использованием различных генетических маркеров, наиболее часто используют маркеры, не требующие значительных затрат в лаборатории. Некоторые исследования показывают низкую эффективность RAPD-маркеров вследствие низкой воспроизводимости [15, с. 95], [32, с. 9]. Использование микросателлитных маркеров (SSR) лимитируется необходимостью дорогостоящего геномного секвенирования и биоинформационного анализа для поиска полиморфных SSR-локусов, с целью последующего подбора эффективных ПЦР пар праймеров [33, с. 53], [34, с. 1]. В данном случае эффективнее использовать маркеры, отличающиеся широким распределением в геноме и универсальностью для любого вида. К таким маркерам можно отнести повторяющиеся последовательности разнообразных классов ретротранспозонов. Ретротранспозоны имеют универсальный сайт праймирования tRNA (PBS), последовательности которого комплементарны минимум 12 нуклеотидам tRNA-последовательностей. Это является достаточным для применения их в качестве ПЦР-праймеров с последующей детекцией полиморфизма в агарозном геле [21, с. 233], [35, с. 453]. Данный метод позволяет анализировать полиморфизм ретротранспозонов любого организма без предварительного изучения последовательностей. Данный метод был успешно применен для исследования полиморфизма грибов [25, с. 307], [26, с. 76], [27, с. 20]. Проведенные нами исследования показали высокий уровень информативности используемых праймеров. Количество амплифицированных фрагментов было достаточным для проведения идентификации генетического полиморфизма, уровень которого был высоким и варьировал от 47,43 % до 80,81 %. Количество генерированных бендов (как общих, так и полиморфных) было высоким и сопоставимо с аналогичными результатами у других исследователей [25, с. 307], [36, с. 28], [37, с. 142]. Используемые нами праймеры (2221, 2237, 2242) с высоким уровнем насыщения спектров амплификации позволили разделить выделенные генотипы, в соответствии с их таксономической классификацией. Это указывает на возможность в дальнейшем использовать данный метод для разработки системы идентификации сложного фитопатогенного вида Alternaria. Наши результаты подтверждают, что iPBS-анализ является мощным и полезным инструментом для анализа внутривидовой изменчивости этих грибов. Благодарности (Acknowledgements)Работа выполнена в рамках проекта АР 05130404.