Аннотация. В настоящее время молекулярно-генетические методы с использованием ДНК-маркеров все шире используются в исследованиях полиморфизма различных популяций древесно-кустарниковых растений. Целью данной работы явились оценка и подбор протоколов выделения и очистки ДНК из листьев гледичии трехколючковой (Gleditsia triacanthos L.) для дальнейших исследований с применением ДНК-маркирования. Методы. Для выделения ДНК из листовой пластинки гледичии трехколючковой использовали четыре протокола. В трех протоколах выделения для лизиса клеток использовали анионный детергент додецилсульфат натрия, для очистки от полисахаридов и белков ацетат калия. В четвертом протоколе для лизиса клеток использовали катионный сурфактант цетилтриметил бромид аммония, очистку экстракта проводили смесью хлороформа и изоамилового спирта (24 : 1). Осаждение выделенной ДНК проводили изопропанолом, оценку качества – методом спектрофотомерии, горизонтального электрофореза и ПЦР Real-time с двумя типами праймеров. Результаты. Подобраны оптимальные условия экстракции ДНК из образцов гледичии трехколючковой, содержащей большое количество метаболитов, влияющих на качество выделенного экстракта. Методом электрофореза установлено, что и протокол выделения с додецилсульфатом натрия, и протокол выделения с цетилтриметил бромидом аммония позволяют получить достаточное количество ДНК. Наиболее очищенная ДНК была получена по третьему протоколу с использованием додецилсульфата натрия и дитиотреитола и по четвертому протоколу с использованием цетилтриметиламмония бромида. Результаты ПЦР полученных образцов с праймерами ITS и psbI-psbK свидетельствуют о получении достаточного количества продукта и воспроизводимости ISSR-маркеров. Научная новизна работы состоит в выборе оптимального метода экстракции ДНК из листьев гледичии трехколючковой, являющейся сложным объектом, содержащим большое количество потенциальных ингибиторов ПЦР. Протокол с додецилсульфатом натрия и дитиотреитолом позволил получить ДНК в нужном количестве и приемлемого качества.
Abstract. Currently, molecular genetic methods using DNA markers are increasingly used in studies of polymorphism of various populations of woody and shrubby plants. The purpose of this work was the evaluation and selection of protocols for the isolation and purification of DNA from the leaves of Gleditsia triacanthos L. for further studies using DNA labeling. Methods. Four protocols were used to isolate DNA from the leaf blade of Gleditsia triacanthos L. Anionic detergent sodium dodecyl sulfate was used in three isolation protocols for cell lysis, potassium acetate was used for purification from polysaccharides and proteins. In the fourth protocol, a cationic surfactant cetyltrimethyl ammonium bromide was used for cell lysis, the extract was purified with a mixture of chloroform-isoamyl alcohol (24 : 1). Precipitation of the isolated DNA was carried out with isopropanol. The quality of the isolated DNA was evaluated by spectrophotometry, horizontal electrophoresis and Real-time PCR with two types of primers. Results. Optimal conditions for DNA extraction from samples of Gleditsia triacanthos L. containing a large number of metabolites affecting the quality of the isolated extract were selected. By electrophoresis, it was found that both the isolation protocol with sodium dodecyl sulfate and the isolation protocol with cetyltrimethyl ammonium bromide make it possible to obtain a sufficient amount of DNA. The most purified DNA was obtained by the third protocol using sodium dodecyl sulfate and dithiotreitol and by the fourth protocol using cetyltrimethylammonium bromide. The results of PCR of the obtained samples with ITS and psbI-psbK primers indicate that a sufficient amount of product has been obtained and the reproducibility of ISSR markers. The scientific novelty of the work consists in choosing the optimal method of DNA extraction from the leaves of Gleditsia triacanthos L., which is a complex object containing a large number of potential PCR inhibitors. The protocol with sodium dodecyl sulfate and dithiotreitol made it possible to obtain DNA in the right amount and of acceptable quality.