Постановка проблемы (Introduction)H. gmelinii, или копеечник Гмелина, относится к семейству бобовых. Род копеечников (Hedysarum) включает в себя около 300 видов [1] однолетних или многолетних трав, произрастающих в Азии, Европе, Северной Африке и Северной Америке [2]. Ареал вида H. gmelinii образуется из двух разобщенных частей, где азиатская имеет большую площадь и охватывает в том числе часть Сибири, а меньшая расположена в западном Приуралье (Республика Башкортостан, Республика Татарстан, Пермская и Оренбургская области) и Поволжье (Самарская, Волгоградская, Ульяновская, Саратовская области). Ареал вида является дизъюнктивным, что связано с облигатной кальцефильностью вида, произрастающего на меловых и известняковых субстратах. [3, с. 60]. У H. gmelinii простой полный онтогенез, включающий четыре периода и десять возрастных состояний, однотипный во всех исследованных условиях произрастания, продолжительностью около 50 лет [4, с. 72]. В настоящей работе были использованы семена, собранные в западной части ареала, а именно в Башкортостане и Татарстане. Основная цель нашей исследовательской работы заключалась в подборе оптимальной среды на основе широко распространенной питательной среды Мурасиге – Скуга для введения в культуру in vitro перспективного вида H. gmelinii.Растения рода Hedysarum активно и на протяжении длительного периода используются в качестве лекарственного сырья в китайской народной медицине. Проявляемый интерес к данной группе растений связан с повышенным содержанием различных биологически активных соединений, которые локализованы преимущественно в корневой системе, однако прорабатывается возможность получения удовлетворительного выхода ряда перспективных соединений и из надземной части. В перечень биологически активных веществ входят флавоноиды, тритерпеноиды, кумарины, лигнаны, алкалоиды, аминокислоты, стеролы, высшие жирные кислоты, полисахариды и дубильные вещества. В ранних исследованиях (Г. С. Глызина и Н. Ф. Комиссаренко 1967 г., Г. И. Высочина и др. 2011 г., Yi Liu и др. 2018 г. и 2019 г.) из H. gmelinii были получены флавоноиды (2,6 %) 3-α-L-рамнофуранозидквертицина, 3-α-L-арабинофуранозидквертицина; халконы хедизарумин А, хедизарумин B, паратокарпин Е; птерокарпан 3-гидрокси-9-метоксиптерокарпан; тритерпеноиды лупеол, соясапогенол, сквазапогенол; кумарин 3,9-дигидроксикуместан; стерол β-ситостерол; высшая жирная кислота пальмитиновая кислота, а также 2,3-дигидроксипропиловый эфир гексадекановой кислоты [5–8] Также можно выделить сахарозу и моносахара из листьев (1,95 %), цветков (7,16 %), плодов (3,42 %) [9, 10].Различные экстракты растений рода Hedysarum обладают антиоксидантными, антивозрастными, противоопухолевыми, антидиабетическими свойствами [5–11], участвуют в регуляции процессов иммунной системы. Фармакологическим потенциалом обладают не только взрослые и полностью сформированные растения. В работе группы ученых (Jon Krakauer, Ying Long, Andrew Kolbert и др., 2015 г.) было установлено, что в семенах H. alpinum в достаточной концентрации содержится L-канаванин, который способен спровоцировать смерть человека [12]. Подобный случай произошел в 1992 г. на Аляске, когда Кристофер Маккэндлесс, зная о том, что корни H. alpinum съедобны, употребил в пищу семена этого растения, после чего скончался. Этот факт акцентирует внимание на необходимости изучения состава биологически активных веществ, содержащихся во всех частях растения.Также определенный интерес вызывают симбиотические отношения между H. gmelinii и клубеньковыми бактериями. В исследовании 2017 г. (А. Л. Сазанова, И. Г. Кузнецова, В. И. Сафронова и др.) было установлено, что среди микросимбионтов этого растения встречаются штаммы симбиотических видов клубеньковых бактерий (Rhizobium sp.), а также атипичные виды, представители которых не образуют симбиоз (Phyllobacterium endophyticum, Ph. Loti и Boseasp.) [13]. Штаммы не симбиотических видов ризобий могут присутствовать в клубеньках как носители генов, которые не участвуют непосредственно в формировании симбиоза, но могут влиять на его эффективность. Дальнейшее фенотипическое и генетическое изучение изолированных микроорганизмов может внести существенный вклад в понимание путей эволюции и развития растительно-микробных взаимодействий в бобово-ризобиальной системе. Симбиотические взаимоотношения являются жизненно необходимыми для растения и в изменяющихся условиях окружающей среды важно установить, как загрязнение почвы влияет на самих микросимбионтов. В исследовании 2015 г. (Hui Yan, Zhao Jun Ji, Yin Shan Jiao и др.) было установлено, что H. polybotrys связывался с Mesorhizobium septentrionale [14]. Результаты показали, что плодородие почвы может выступать ведущим фактором, определяющим распределение ризобий, связанных с этим культивируемым растением. Обладая высоким фармакологическим потенциалом, избирательностью к условиям своего произрастания, а также являясь, наряду с другими представителями сем. Fabaceae прекрасным кормовым растением H. gmelinii, является перспективным объектом изучения, сохранения путем введения в культуру invitro, а также разработки стратегии по его использованию [15]. Методология и методы исследования (Methods)Семенной материал H. gmelinii был собран в Татарстане и Башкортостане и хранился до момента использования при 4 °C.Компонентный состав среды Мурасиге – Скуга, используемый нами для введения в культуру H. gmelinii, представлен в таблице.ТаблицаСостав среды Мурасиге – СкугаКомпонентыКоличество, мг (если не указано иное)NH4NO31650KNO31900CaCl2 плав310MgSO4 × 7H2O370KH2PO4170Микроэлементы по Мурасиге – Скуга1 млFe-хелат5 млМезоинозит100Витамины по Мурасиге – Скуга1 млСахароза30 гАгар8 гВода1 лГормоны (варианты)6-бензиламинопурин (БАП), мгГетероауксин (ИУК), мг1––21,00,130,11,041,01,0    TableThe composition of the Murashigeand Skoog mediumIngredientsAmount of substance, mg (unless otherwise stated)NH4NO31650KNO31900CaCl2310MgSO4 × 7H2O370KH2PO4170Micronutrients of MS1 mlFe-chelate5 mlMesoinosit100Vitamins of MS1 mlSaccharose30 gAgar8 gWater1 lHormones (versions)6-benzylaminopurine (BAP), mgIndole-3-acetic acid (IAA), mg1––21,00,130,11,041,01,0     После приготовления питательную среду разливали в объеме 25 мл в стеклянную посуду и автоклавировали. Перед стерилизацией все семена очищали от сухих оболочек. Из каждой популяции нами было отобрано по 100 штук зрелых семян. Далее материал переносили в отдельные стаканы и подвергали стерилизации. В процессе следили, чтобы все семена были равномерно смочены и полностью находились в растворе.На первом этапе стерилизации семенной материал погружали в 75-процентный спирт на 3 минуты. Далее переносили в гипохлорид 3 % (раствор Белизны) на 10 минут, после чего семена отмывали в стерильной дистиллированной воде по 10 минут 3 раза, активно перемешивая, после каждого раза вода менялась.Семена помещали на питательную среду так, чтобы избежать загущения и снизить риск возможной контаминации. При высаживании каждое семя после окончания стерилизации накалывали предварительно обожженной иглой. Семена проращивались при температуре 20 °С и 16-часовом световом дне.Далее при проведении пересаживания проростков, а затем и взрослых растений на новую питательную среду повторная стерилизация не проводилась, оставался неизменным и ее состав. Результаты (Results)Изучая доступные источники литературы, заключили, что H. gmelinii является перспективным видом для интродукции, а также данный вид нуждается в защите для восстановления численности природных популяций. H. gmelinii относится к секции Multicaulia [16–18]. В исследовании Yi Liu с соавторами в 2019 г. была подтверждена более тесная генетическая связь между данной секциями Multicaulia и Subacaulia. Также было обнаружено, что изофлавоноиды и птерокарпаны являются общими составляющими рода Hedysarum, особенно среди трех травянистых секций (Obscura, Multicaulia и Subacaulia), в то время как халконы (особенно пренилированные халконы) могут быть характерными составляющими секций Multicaulia и Subacaulia. Характерными составляющими секции Fruticosa (H. polybotrys) являются птерокарпаны, бензофураны и куместаны [19]. Таким образом, при недостатке теоретических данных о содержании какого-либо вещества в H. gmelinii можно сделать предположение о его наличии, основываясь на результатах близкородственных видов данного рода, и далее уже в лабораторных условиях попытаться получить искомое вещество, используя культуру ткани. Из-за эколого-биологических особенностей и частого использования человеком некоторые виды рода Hedysarum находятся в положении резкого сокращения численности популяции. H. gmelinii состоит в данный момент в Красной книге Республики Татарстан [20]. Был отмечен и в Красных книгах других регионов (Республика Башкортостан – 2001 г., Курганская область – 2012 г., Омская область – 2015 г., Оренбургская область – 2014 г., Самарская область – 2017 г., Республика Саха (Якутия) – 2017 г., Ульяновская область – 2015 г., Челябинская область – 2017 г.) [21], [22, с.88], [23], [24, с.112]При этом растения рода Hedysarum могут использоваться не только непосредственно в фармакологической промышленности, но и как кормовое сырье. Растение способно давать высокие приросты показателей биомассы в летний период, но его продуктивность варьирует в зависимости от условий произрастания (тип субстрата, уровень освещенности, влажность и температура воздуха). Копеечники, произрастающее в кустарниково-разнотравно-злаковых степях на террасах горных рек, на остепненных лугах без пастбищной нагрузки, а также в поймах горных рек, имеют высокие значения основных биолого-морфологических характеристик, таких как диаметр каудекса, число побегов, число листьев и соцветий, биомасса надземной части особи. Наименьшие показатели биомассы представлены у растений ценопопуляций, произрастающих в условиях остепненного луга с пастбищной дигрессией и полынно-мелкодерновинно-злаковой степи. Также копеечники привлекают внимание исследователей, являясь прекрасным сырьем для биотоплива. Стебли H. coronarium содержат значительное количество общих растворимых сахаров и полисахаридов в клеточной стенке, в отличие от листьев, которые богаты белками и лучше всего подойдут в качестве кормового вида для скота. Таким образом, использование этого растения в аграрной промышленности может решать одновременно несколько разнонаправленных задач [25], [26].Интересны исследования, изучающие влияние копеечника на рост шерсти скота [27], противогельминтное действие растения [28], [29].На всхожесть семян в условиях in vitro влияет множество факторов (от качества питательной среды и частоты пересевания до условий экспозиции), и поиск подходящих условий для культивирования является актуальной проблемой. После посева на питательную среду семена активно начали прорастать к 15 дню. Далее мы провели пересадку наиболее перспективных и жизнеспособных проростков на свежую питательную среду, на которой еще через 13 дней были сформированы молодые растения с хорошо развитой вегетативной частью (см. рис.). Одним из объектов изучения может стать активная форма кислорода (АФК), которая оказывает благоприятное воздействие на процессы прорастания семян. В работе 2016 г. (Liqiang Su, Qinying Lan, Hugh W. Pritchard, Hua Xue, Xiaofeng Wang) было установлено, что АФК, применяемая вместе с фитогормонами, увеличивает всхожесть семян, а также сокращает время прорастания H. scoparium [30].Корневая система запаздывала в росте. Вероятно, для успешного развития корневой системы у молодых растений необходима соответствующая дополнительная гормональная стимуляция. И в естественных условиях у копеечников существуют особенности в онтогенетическом развитии. По результатам проведенных исследований (С. А. Сенатор, 2017 г.) определены онтогенетические (возрастные) спектры ценопопуляций плейстоценового реликта H. gmelinii в европейской части ареала. Семь ценопопуляций Средней Волги и Приуралья отличаются довольно высокой плотностью. Онтогенетический спектр в большинстве случаев неполночленный, что связано с быстрым отмиранием растений после завершения генеративного состояния, а также тем, что H. gmelinii произрастает в сообществах с развитой дерниной, препятствующей прорастанию семян и развитию молодых растений. В случае когда вид произрастает на меловых отложениях, в сообществах с разреженным травостоем, семена часто смываются осадками или сдуваются ветром с поверхности субстрата, а образовавшиеся проростки испытывают значительный недостаток влаги и элиминируют. Существенное влияния на молодые растения здесь оказывают эрозионные процессы на склонах [31], [32, с. 47].Многочисленные новые вегетативные почки появлялись на поверхности каллуса. Каллус формировался в большинстве случаев плотным по структуре, но слабо окрашенным. При последующих делениях рост каллуса и образование почек не замедлялись, то есть развитие происходило не волнообразно, что указывает на оптимально подобранную концентрацию гормонов. Способность к ускоренной дифференциации клеток каллуса возможно использовать на этапах увеличения общей массы культуры.а)                                            б)a)                                            b)Рис. Взрослое растение H. gmelinii, выращенное в условиях invitro:а) Башкирия, б) ТатарстанFig. Adult H.gmelinii plant grown in vitro:a) Bashkortostan, b) Tatarstan Для стимуляции ростовых процессов при успешном вегетативном делении провели пересадку растений и частей кустов на свежую питательную среду еще через месяц. При частой смене среды растения H. gmelinii не показывают увядания листьев, что было отмечено нами в большей степени на материале из Башкирии, где при сохранении оптимальных условий наблюдали увядание развитых листьев. Наиболее активный рост показали проростки из Татарстана. При делении отдельных молодых кустов активное образование каллусной ткани наблюдали у представителей H. gmelinii из Татарстана, тогда как растения, произрастающие в Башкирии, показывают спад ростовой активности.Обсуждение и выводы (Discussion and Conclusion)Предложенный нами состав среды можно считать подходящим для проращивания семян H. gmelinii, а также для формирования культуры тканей. Наиболее перспективными для формирования культуры H. gmelinii можно считать семенной материал растений, произрастающих в Татарстане. Растения демонстрируют хорошие рост и ветвление. Таким образом, нами была получена культура, которая успешно культивируется в условиях in vitro. Данную культуру планируется использовать для сравнительного изучения биологически активных веществ, входящих в состав разнообразных экстрактов H. gmelinii, а также для формирования коллекции открытого грунта на территории Ботанического сада УрО РАН.Благодарности (Acknowledgements)Авторский коллектив выражает благодарность за предоставленный семенной материал доктору биологических наук М. С. Князеву и кандидату биологических наук Е. Г. Филиппову.