V nastoyaschee vremya razvivayuschiesya embriony kur prodolzhayut ostavat'sya syr'em dlya proizvodstva virusnyh vakcin. Suschestvuet potrebnost' v selekcionnyh resheniyah, napravlennyh na poluchenie yaic, soderzhaschih vysokiy uroven' vyhoda ekstraembrional'noy zhidkosti (VEEZh). V bioresursnoy kollekcii VNIIGRZh «Geneticheskaya kollekciya redkih i ischezayuschih porod kur» na osnove populyacii russkih belyh kur vedetsya rabota po sozdaniyu liniy pticy s vysokim VEEZh. Cel' nastoyaschey raboty – vyyavit' associaciyu zameny S/T v polozhenii rs13730111 v genome kur-materey s razlichnym urovnem VEEZh u embrionov, a takzhe oharakterizovat' embriony kur po dannym zootehnicheskogo ucheta. Obnaruzheno, chto pokazatel' VEEZh v kurinyh embrionah associirovan s genotipom materey po zamene rs13730111. Naibol'shiy VEEZh embrionov nablyudalsya u kur, obladavshih gomozigotnym genotipom TT (n = 3, r < 0,05), naimen'shiy – u osobey s genotipom SS (n = 87, r < 0,05). Pri etom v populyacii s chastotoy 0,8 vstrechalsya allel' S, a chastota allelya T sostavila vsego 0,2. Otkloneniya ot geneticheskogo ravnovesiya obnaruzheno ne bylo (χ2 = 2,4 pri f = 1). Ocenka dannyh zootehnicheskogo ucheta kurinyh embrionov pokazala, chto raspredelenie po priznaku VEEZh priblizhaetsya k normal'nomu. Sredniy vyhod zhidkosti u embrionov (n = 431) sostavil 11,7 + 2,06 ml. Otmechena vysokaya polozhitel'naya korrelyaciya (r = 0,599) mezhdu massoy yayca pri zakladke na inkubaciyu i VEEZh. Povyshenie procenta usushki yayca v hode razvitiya embriona privodit k snizheniyu VEEZh (r = –0,334). Obnaruzhennye zakonomernosti mozhno ispol'zovat' pri ocenke pticy v hode selekcii.
kurinyy embrion, vyhod ekstraembrional'noy zhidkosti, kury, russkaya belaya poroda, SNP, polimorfizm.
Введение
В настоящее время развивающиеся эмбрионы кур (РЭК) продолжают оставаться базой для производства вирусных вакцин. Существует потребность в селекционных решениях, направленных на получение яиц, содержащих высокий выход экстраэмбриональной жидкости (ВЭЭЖ). Повышение ВЭЭЖ приводит к увеличению титра вируса, что дает существенный экономический эффект для производителей биологических препаратов.
Генофондные породы кур отличаются фенотипическим разнообразием по сравнению с промышленной птицей, обладают высоким уровнем адаптации к различным условиям окружающей среды, качественным мясом, уникальными генетическими особенностями и внешним видом [1]. Одной из таких пород является русская белая, разведение которой началось с 1929 года со скрещивания местных цыплят с представителями породы белый леггорн, импортированной из Дании, Великобритании и США в Пятигорский и Кучинский племенные центры [2].
С 1953 года русские белые куры разводятся на базе биоресурсной коллекции «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» (ВНИИГРЖ) (http://vniigen.ru/ckp-geneticheskaya-kollekciya-redkix-i-ischezayushhix-porod-kur/). До 2003 года популяция подвергалась сильному селекционному давлению, направленному на отбор цыплят по устойчивости к низким температурам выращивания. Этот признак предположительно контролировался рецессивным геном sw, определяющим цвет пуха у суточных цыплят [3]. В настоящее время русские белые куры используется для создания линий птицы, пригодной для производства вирусных вакцин. Использование развивающихся куриных эмбрионов позволяет увеличить производство вакцин и расширить спектр вирусов, культивируемых в лаборатории [4].
Большой интерес к экстраэмбриональной жидкости куриных эмбрионов направлен на изучение ее физико-биохимической структуры [5], анализа содержащихся в ней белков [6] или иммунологических свойств [7]. В то же время генетика признака ВЭЭЖ в развивающихся эмбрионах кур изучена недостаточно, мало внимания уделяется и ассоциациям этого признака с другими показателями [8]. Сканирование генома кур русской белой породы с помощью чипа Illumina 60KBeadChip позволило выявить значимые однонуклеотидные замены, достоверно влияющие на уровень ВЭЭЖ. В первую очередь это замена С/Т в положении rs13730111 на хромосоме 2 у кур [9]. Дальнейшее изучение выявленных ассоциаций и отбор по полиморфным вариантам в этой замене может стать основой для проведения раннего отбора кур.
Цель и методика исследований
Цель нашего исследования – выявить ассоциацию замены С/Т в положении rs13730111 в геноме кур-матерей с различным уровнем ВЭЭЖ у эмбрионов, а также охарактеризовать эмбрионы кур по данным зоотехнического учета.
Материалом для исследования послужили данные по двум группам кур:
- родительская группа (n = 141), которая была прогенотипирована с помощью чипа Illumina 60KBeadChip по замене в положении rs13730111 и оценена по уровню выхода экстраэмбриональной жидкости (мл) в эмбрионах;
- 12,5-суточные эмбрионы (n = 430), полученные от потомков оцененных кур, для которых измерили следующие показатели: массу яйца (г) при снесении, массу яйца (г) на 12,5 суток инкубации, усушку (%), выход экстраэмбриональной жидкости (мл), массу эмбриона (г).
Массу яйца и эмбрионов определяли путем взвешивания на весах марки «Госметр» с точностью до 0,1 г. Объем выхода экстраэмбриональной жидкости измеряли с помощью мерного цилиндра (точность 0,1 мл). Процент усушки рассчитывали по формуле: (масса яйца на 12,5 суток инкубации / масса яйца при закладке) × 100 (%).
Данные по фенотипической вариабельности исследуемых признаков были обработаны биометрически с использованием программы Microsoft Office Excel 2007. При этом вычислены следующие величины: среднеарифметическая (М), среднеквадратическая ошибка (± m) и уровень значимости (р).
Результаты исследований
На основании полногеномного генотипирования родительской группы кур были получены частоты генотипов и аллелей по замене rs13730111. Подавляющее большинство особей в группе составили гомозиготы СС (n = 87), а реже всего встречались куры с генотипом ТТ (n = 3). В результате в изученной популяции наблюдалось преобладание аллеля С.
При этом рассчитанное для группы значение χ2 = 2,4 ниже критического (χ2 = 3,84, при f = 1), а значит, популяция находится в генетическом равновесии (таблица 1).
При сравнении уровня выхода экстраэмбриональной жидкости у кур с разными генотипами наибольшие значения наблюдались у гомозигот ТТ, которые достоверно превосходили по этому показателю кур с генотипом СС. Достоверные отличия по уровню амниотической жидкости отмечены также между курами с генотипом СС и гетерозиготами СТ (таблица 1).
Таблица 1
Выход экстраэмбриональной жидкости (ВЭЭЖ) в эмбрионах кур в зависимости от генотипов по замене rs13730111
Table 1
Output of extraembryonic fluid in chick embryos depending on genotypes by replacing rs13730111
|
Показатели Indicators |
Генотипы Genotypes |
Аллели Alleles |
|||
|
CC |
CT |
TT |
С |
Т |
|
|
Поголовье, n Livestock, n |
87 |
51 |
3 |
|
|
|
Частота Frequency |
0,62 |
0,36 |
0,02 |
0,8 |
0,2 |
|
ВЭЭЖ, мл YEF, ml |
8,96 ± 0,161,2 |
10,14 ± 0,231 |
12,20 ± 1,562 |
|
|
1,2 различия статистически значимы, р < 0,05
1, 2 the differences are statistically significant, p <0.05
На рис. 1 представлен график распределения 12,5-суточных эмбрионов (n = 430), потомков родительской популяции, по уровню выхода амниотической жидкости. Распределение приближается к нормальному, что позволит в дальнейшем выбрать для генотипирования по rs13730111 особей с разным уровнем ВЭЭЖ, чтобы оценить влияние генотипа самого эмбриона на этот показатель.
Рис. 1. Распределение 12,5-суточных эмбрионов (n = 430) по уровню выхода амниотической жидкости (по x – выход экстраэмбриональной жидкости, мл; по y – количество эмбрионов с определенным уровнем ВЭЭЖ)
Fig. 1. The distribution of 12.5-day embryos (n = 430) according to the level of amniotic fluid (x is the yield of extraembryonic fluid, ml; y is the number of embryos with a certain level of YEF)
Оценка 12,5-суточных эмбрионов по фенотипической вариабельности признаков, ассоциированных с выходом амниотической жидкости, представлена в таблице 2. Следует отметить высокую массу яйца у представителей русских белых кур (58,59 ± 5,01 г), что превышает стандарт породы по этому показателю (56–57 г) [10].
Таблица 2
Вариабельность фенотипических признаков 12,5-суточных эмбрионов (n = 430) кур русской белой породы
Table 2
Variability of phenotypic characteristics of 12.5-day embryos (n = 430) of Russian white breed chickens
|
Показатели Indicators |
M ± m |
Среднее Median |
Минимум Min |
Максимум Max |
|
Масса яйца, г Egg weight, g |
58,59 ± 5,01 |
58,3 |
45,9 |
77,0 |
|
Масса яйца на 12,5 сутки инкубации, г The weight of the eggs on the 12.5 day incubation, g |
54,3 ± 4,88 |
54,0 |
42,0 |
70,6 |
|
Масса эмбриона, г Embryomass, g |
5,69 ± 0,56 |
5,7 |
2,9 |
7,1 |
|
ВЭЭЖ, мл YEF, ml |
11,7 ± 2,06 |
12,0 |
6,5 |
17,0 |
|
Усушка, % Drying, % |
7,39 ± 1,52 |
7,2 |
2,9 |
16 |
Анализ корреляций между основными фенотипическими признаками, изучаемыми при анализе 12,5-суточных эмбрионов, показал, что наибольшая взаимосвязь наблюдалась между массой яйца при закладке на инкубацию и выходом экстраэмбриональной жидкости (r = 0,599). Отмечена отрицательная корреляция показателя ВЭЭЖ с процентом усушки (r = –0,334).
Выводы. Рекомендации
Обнаружены ассоциации показателя выхода экстраэмбриональной жидкости в куриных эмбрионах с генотипом по замене rs13730111. Наибольший ВЭЭЖ наблюдался у гомозигот ТТ, наименьший – у особей с генотипом СС. При изучении эмбрионов кур распределение по признаку ВЭЭЖ приближается к нормальному. Средний выход жидкости у эмбрионов составил 11,7 ± 2,06 мл. Отмечена высокая положительная корреляция (r = 0,599) между массой яйца при закладке на инкубацию и ВЭЭЖ. Повышение процента усушки яйца в ходе инкубации приводит к снижению выхода экстраэмбриональной жидкости в эмбрионах кур (r = –0,334). Обнаруженные закономерности можно использовать при оценке птицы в ходе селекции.
Таблица 3
Коэффициент линейной корреляции (r) между фенотипическими признаками яиц кур русской белой породы на 12,5 сутки инкубации
Table 3
The linear correlation coefficient (r) between the phenotypic characteristics of eggs of chickens of the Russian white breed on the 12.5-day incubation
|
Корреляции Correlations |
r |
|
Масса яйца – масса эмбриона Egg mass – embryo mass |
0,124 |
|
Масса яйца – ВЭЭЖ Egg mass –YEF |
0,599 |
|
Масса эмбриона – ВЭЭЖ Embryo mass – YEF |
0,183 |
|
Масса яйца – усушка, % Egg mass – drying, % |
–0,154 |
|
Масса эмбриона – усушка, % Embryo mass – drying, % |
–0,088 |
|
Усушка, % – ВЭЭЖ Drying, % – YEF |
–0,334 |
Благодарности
Исследование выполнено при финансовой поддержке Минобрнауки России по теме Государственного задания «Изучение структурной и функциональной изменчивости животных и птиц на основе использования ДНК-маркеров с целью оценки аллельного биоразнообразия и идентификации ценных генотипов для внедрения в селекционный процесс» АААА-А18-118021590138-1.
Коллектив авторов выражает благодарность Ольге Игоревне Станишевской, руководителю Отдела генетики, разведения и сохранения генетических ресурсов сельскохозяйственных птиц ВНИИГРЖ (г. Санкт-Петербург – Пушкин) за предоставленный для работы зоотехнический и биологический материал.
1. Stanishevskaya O. I., Cherepanov S. V., Silyukova Yu. L. Organizational aspects of the conservation of genetic resources of farm animals: international experience // Genetics and animal breeding. 2017. No. 3. Pp. 3-11.
2. Yurchenko O., Makarova A., Karpukhina I., Vakhrameev A. Domestic Breeds and Populations of Chickens // Russian Animal Husbandry. 2017. No. 2. Pp. 7-10.
3. Dementyeva N. V., Romanov M. N., Kudinov A. A., Mitrofanova O. V., Stanishevskaya O. I., Terletsky V. P., Fedorova E. S.,. Nikitkina E. V, Plemyashov K. V. Studying the structure of a gene pool population of the Russian white chicken breed by genome-wide SNP scan // Agricultural biology. 2017. Vol. 52. Pp. 1166-1174.
4. Lapa M. A. Influence of the genotype of mothers, fathers and the age of developing chick embryos on the volume and quality of allantoic-amniotic fluid // Genetics and animal breeding. 2015. No. 1. Pp. 14-20.
5. Omede A. A., Bhuiyan M. M., Lslam A. F., Iji P. A. Physico-chemical properties of late-incubation egg amniotic fluid and a potential in ovo feed supplement // Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 2017. Vol. 30 (8). Pp. 1124-1134.
6. DaSilva M., Dombre C., Brionne A., Monget P., Chessé M., De Pauw M., Mills M., Combes-Soia L., Labas V., Guyot N., Nys Y., Réhault-Godbert S. The unique features of proteins depicting the chicken amniotic fluid // Molecular & Cellular Proteomics. 2019. Vol. 15 (18). Pp. 174-190.
7. Hinckea M. T., Da Silva M., Guyot N., Gautron J., McKee M. D., Guabiraba-Brito R., Réhault-Godbert S. Dynamics of structural barriers and innate immune components during incubation of the avian egg: critical interplay between autonomous embryonic development and maternal anticipation // Journal of Innate Immunity. 2019. Vol. 11 (2). Pp. 111-124.
8. Tyapugin E. Breeding for the development of the embryo // Animal Breeding of Russia. 2017. No. S3. Pp. 33-34.
9. Kudinov A. A., Dementyeva N. V., Mitrofanova O. V., Stanishevskaya O. I., Fedorova E. S., Larkina T. A., Mishina A. I., Plemyashov K. V., Griffin D. K., Romanov M. N. Genome-wide association studies targeting the yield of extraembryonic fluid and production traits in Russian white chickens // BMC Genomics. 2019. Apr 4; 20:270.
10. Fedorova E. S., Stanishevskaya O. I., SilyukovaYu. L. The effectiveness of breeding chickens breed Russian white to increase the yield of vaccine materials // Genetics and animal breeding. 2017. No. 3. Pp. 46-50.
