Russian Federation
Ranee bylo pokazano, chto predvaritel'naya inkubaciya spermatozoidov pered zamorazhivaniem v prisutstvii soedineniy, sposobstvuyuschih kapacitacii (dbcAMP, teofillin), povyshaet chislo zhiznesposobnyh kletok posle razmorazhivaniya [1]. V dannoy rabote predvaritel'nuyu inkubaciyu spermatozoidov pered zamorozkoy provodili v prisutstvii soedineniy, aktiviruyuschih kapacitaciyu (kofein) i ne vliyayuschih na etot process (PRL i GTF). Ocenku zhiznesposobnosti spermatozoidov provodili s ispol'zovaniem fluorescentnogo krasitelya propidiuma iodida, pozvolyayuschego po izmeneniyu okraski kletok razdelyat' ih na zhivye i mertvye. Bylo pokazano, chto inkubaciya intaktnyh spermatozoidov bez posleduyuschego zamorazhivaniya v srede bez dobavok v prisutstvii kofeina v koncentracii 2 mM, a takzhe pri sovmestnom deystvii prolaktina (PRL) i GTF v koncentracii 10 ng/ml i 10 mkM sootvetstvenno ne okazyvala vliyaniya na sootnoshenie chisla zhivyh i mertvyh kletok. Vo vseh variantah eksperimentov chislo zhivyh spermatozoidov bykov prevyshalo kolichestvo mertvyh kletok primerno v 3 raza. V spermatozoidah bykov, kotorye pered zamorozkoy inkubirovali v techenie 4 chasov bez vysheukazannyh reagentov, posle razmorazhivaniya sootnoshenie kolichestva zhivyh i mertvyh kletok sostavilo 1:1. Predvaritel'naya inkubaciya spermatozoidov pered zamorazhivaniem v prisutstvii kofeina posle razmorazhivaniya/ottaivaniya obespechila uvelichenie chisla zhiznesposobnyh spermatozoidov i snizhenie kolichestva mertvyh kletok. Pri inkubacii spermatozoidov v techenii 4 chasov pered kriokonservaciey v prisutstvii PRL i GTF, zamorazhivanii i posleduyuschem ottaivanii kletok chislo zhiznesposobnyh kletok ne izmenilos'. Takim obrazom, predvaritel'naya inkubaciya spermatozoidov pered kriokonservaciey s kofeinom, obespechivayuschaya uvelichenie chisla kapacitirovannyh kletok, privodit k rostu chisla zhiznesposobnyh spermatozoidov posle razmorazhivaniya.
zhiznesposobnost', zamorozka, spermatozoidy bykov.
Цель и методика исследований
Возрастающий интерес в повышении качества замороженной спермы быков в последние годы был определен снижением плодовитости молочных коров [3, 9]. Замораживание и оттаивание спермы быков приводит к уменьшению процента жизнеспособных клеток примерно до 50–60 % [7]. Поэтому при использовании замороженной спермы требуется увеличение концентрации мужских гамет, необходимой для оплодотворения, более чем в три раза, чтобы достичь показателей эффективности осеменения незамороженной спермой [8].
Известно, что процесс замораживания/оттаивания спермы не только приводит к деструктивным изменениям липидного состава мембраны, но и к снижению подвижности сперматозоидов и их жизнеспособности, деструкции ДНК [11]. Особенности клеточной структуры сперматозоидов и их плазматической мембраны, низкая активность антиоксидантной системы сперматозоидов делают их уязвимыми для свободных радикалов, которые в большом количестве образуются во время процесса криоконсервации [10].
Добавление холестерина в криопротекторы улучшает способность спермы к криоконсервации за счет сохранения целостности мембраны и гидрофобности, уменьшения осмотического стресса [5]. Было показано, что БСА (бычий сывороточный альбумин) увеличивает подвижность и жизнеспособность сперматозоидов после длительного хранения при низких температурах [6]. Таким образом, совершенствование криосред позволило бы повысить эффективность криоконсервации спермы.
Целью работы явилось изучение влияния кофеина на жизнеспособность интактных и размороженных сперматозоидов быков. Использование кофеина было связано с необходимостью активации в сперматозоидах быков процессов капацитации [2], в то время как совместное действие ПРЛ и ГТФ приводило к активации актросомной реакции [4].
В экспериментах использовали свежие эякуляты от трёх разных быков чёрно-пёстрой породы. Для удаления семенной плазмы спермиев отмывали двумя последовательными центрифугированиями в течение 10 минут при 300 g в среде Sp-TALP, которая состояла из 100 мМ NaCl, 3,1 мМ KCl, 25 мМ NaHCO3, 0,3 мМ NaH2PO4, 21,6 мМ лактата натрия, 0,5 мМ CaCl2, 0,4 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия и 0,1 % поливинилалкоголя. Инкубация спермы экспериментальных групп проводилась в среде Sp-TALP с 6 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) без или в присутствии различных добавок: 2 мМ кофеина, 10 нг/мл пролактина (ПРЛ) и 10 мкМ гуанозинтрифосфата (ГТФ). Клетки инкубировались при 38 °С в атмосфере 5 % СО2, 95 % влажности в течение 4 часов. Для замораживания эякулят быков смешивали с разбавителем в соотношении 1:1 при 27 °С и охлаждали до 18–22 °С. Затем проводили итоговое разбавление, фасовку и эквилибрацию (экспозиция при 4 °С в течение 3–4 часов). Сперматозоидов замораживали в течение 7,5 минут до температуры –145 °С. Контейнер с образцами помещали в жидкий азот (–196 °С). Соломины со спермой размораживали на водяной бане (38,5 °С) в течение 1 мин.
Число погибших и живых клеток определяли по стандартной методике с использованием 0,06 % раствора пропидиума иодида. Для подсчёта использовали микроскоп AxioLab. A1 (Carl Zeiss) с фазовым контрастом и эпифлуоресцентной оптикой (при возбуждении 535 нм и излучении –617 нм). Сперматозоиды, имеющие яркую флуоресценцию всей головки, оценивались как мертвые, имеющие слабо окрашенную головку – как живые.
Достоверность различий для 4–5 экспериментов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.
Результаты исследований
Одной из главных проблем в криобиологии является сохранение жизнеспособности при замораживании. Основным подходом, используемым для повышения выхода жизнеспособных клеток после замораживания, является улучшение качества криосред путем подбора криопротекторов. Однако получаемые результаты при этом достаточно скромные. Применение лучших протоколов криоконсервации позволяло пережить замораживание половине клеток исходно подвижной популяции [12]. Использование различных криопротекторов показало, что лучшие показатели подвижности и целостности мембран клетки были в сперматозоидах, при замораживании которых использовали глицерин [7]. Ранее нами на сперматозоидах быков было показано, что предварительная инкубация сперматозоидов перед замораживанием в присутствии соединений, активирующих капацитацию (dbcAMP, теофиллин), приводило к повышению числа жизнеспособных клеток после размораживания [1]. В данной работе предварительную инкубацию сперматозоидов перед заморозкой проводили в присутствии соединений, активирующих капацитацию (кофеин) и не влияющих на этот процесс (ПРЛ и ГТФ).
Рис. 1. Влияние различных соединений на жизнеспособность интактных сперматозоидов быков. По горизонтали: 1 – клетки без инкубации; 2 – клетки, инкубированные 4 ч без добавок (К); 3 – К + добавление кофеина в концентрации 2 мМ; 4 – К + совместное добавление ПРЛ и ГТФ в концентрация 10 нг/мл и 10 мкМ, соответственно
Fig. 1. The effect of various compounds on the viability of intact bovine spermatozoa. Horizontal: 1 - cells without incubation; 2 – cells incubated for 4 hours without additives (K); 3 – K + the addition of caffeine at a concentration of 2 mM; 4 – K + the addition of PRL and GTP at a concentration of 10 ng / ml and 10 μM, respectively
Данные о влиянии различных соединений на жизнеспособность интактных сперматозоидов быков показаны на рис. 1. Видно, что инкубация сперматозоидов в течение 4 часов в отсутствии добавок, а также в присутствии кофеина в концентрации 2 мМ и совместном действии ПРЛ и ГТФ в концентрации 10 нг/мл и 10 мкМ соответственно не приводили к различиям в соотношении числа мертвых и живых клеток.
Рис. 2. Влияние предварительной капацитации сперматозоидов быков перед заморозкой на жизнеспособность клеток после размораживания. По горизонтали: 1 – клетки без инкубации; 2 – клетки, инкубированные 4 ч без добавок (К); 3 – К + добавление кофеина в концентрации 2 мМ; 4 – К + совместное добавление ПРЛ и ГТФ в концентрация 10 нг/мл и 10 мкМ соответственно. Различия достоверны при a:e; c:e; e:g; b:f; d:f; f:hP < 0,001
Fig. 2. The effect of preliminary capacitation of bovine spermatozoa before freezing on the cell viability after thawing. Horizontal: 1 – cells without incubation; 2 – cells incubated for 4 hours without additives (K); 3 – K + the addition of caffeine at a concentration of 2 mM; 4 – K + the addition of PRL and GTP at a concentration of 10 ng/ml and 10 μM, respectively. The differences are significant with a: e; c: e; e: g; b: f; d: f; f: h P <0.001
Результаты экспериментов по идентификации характера влияния предварительной капацитации сперматозоидов быков в присутствии индукторов капапацитации перед заморозкой на жизнеспособность этих клеток после размораживания представлены на рис. 2. Показано, что инкубация клеток в течение 4 ч без добавок, а также в присутствии ПРЛ и ГТФ в концентрации 10 нг/мл и 10 мкМ соответственно не оказывала влияние на соотношение числа мертвых и живых клеток, которое в данном случае равнялось примерно 1:1. В то же время использование при предварительной инкубации кофеина в концентрации 2 мМ приводило к значительному увеличению числа жизнеспособных клеток после их размораживания.
Выводы. Рекомендации
1. Предварительная инкубация сперматозоидов быков в течение 4 часов в присутствии кофеина, а также совместное действие ПРЛ и ГТФ без последующей заморозки не влияли на соотношение числа живых и мертвых клеток во всех сериях проведённых экспериментов.
2. Предварительная инкубация в присутствии ПРЛ, ГТФ и кофеина до замораживания приводила к увеличению числа жизнеспособных клеток после размораживания, тогда как при совместном воздействии ПРЛ и ГТФ без использования кофеина вышеуказанного эффекта не наблюдали.
Работа выполнена при финансовой поддержке ФАНО (Госзадание №АААА-А18-118021590132-9).
1. Denisenko V. Yu., Kuzmina T. I., Boytseva E. N. Induction of the accumulation of Bos taurus spermatozoa before cryopreservation increases their viability after thawing // Genes and cells. 2018. T. XIII. No. 1. Pp. 86-91.
2. Denisenko V. Yu., Boytseva E. N., Kuzmina T. I. Ca2+ release from intracellular depots of Bos taurus spermatozoa depending on their functional state // Tsitologiya. 2015. V. 57. No. 3. Pp. 233-239.
3. Beran J., Stadnik L., Duchacek J., Okrouhla M., Dolezalova M., Kadlecova V., Ptacek M. Relationships among the cervical mucus urea and acetone, accuracy of insemination timing, and sperm survival in Holstein cows// Animal Reproduction Science. 2013a. No. 142. Pp. 28-34.
4. Breininger E., Cetica P. D., Beconi M. T. Capacitation inducers act through diverse intracellular mechanisms in cryopreserved bovine sperm // Theriogenology. 2010. V. 74. No. 6. Pp. 1036-1049.
5. Gürler H., Calisici O., Bollwein H. Inter- and intra-individual variability of total antioxidant capacity of bovine seminal plasma and relationships with sperm quality before and after cryopreservation // Animal Reproduction Science. 2015. No. 155. Pp. 99-105.
6. Chakrabarty P., Negi S., Andrés R. M., Favaro B. Facilitating conservation // Science. 2017. V. 6335 No. 356. Pp. 242-244.
7. Forero-Gonzalez R. A., Celeghini E. C. C., Raphael C. F., Andrade A. F. C., Bressan F. F., Arruda R. P. Effects of bovine sperm cryopreservation using different freezing techniques and cryoprotective agents on plasma, acrosomal and mitochondrial membranes // Andrologia. 2012. No. 44. Pp. 154-159.
8. Meamar M., Shahneh A. Z., Zamiri M. J., Zeinoaldini S., Kohram H., Hashemi M. R., Asghari S. Preservation effects of melatonin on the quality and fertility of native Fars rooster semen during liquid storage // Czech Journal of Animal Science. 2016. No. 61. Pp. 42-48.
9. Stadnik L., Duchacek J., Beran J., Tousova R., Ptacek M. Relationships between milk fatty acids composition in early lactation and subsequent reproductive performance in Czech Fleckvieh cows // Animal Reproduction Science. 2015a. No. 155. Pp. 75-79.
10. Korkmaz F., Malama E., Siuda M., Leiding C., Bollwein H. Effects of sodium pyruvate on viability, synthesis of reactive oxygen species, lipid peroxidation and DNA integrity of cryopreserved bovine sperm // Animal Reproduction Science. 2017. No. 185. Pp. 18-27.
11. Zribi N. Effect of freezing-thawing process and quercetin on human sperm survival and DNA integrity// Cryobiology. 2012. No. 65. Pp. 326-331
12. Yang D. H., McMillan A. G., Standley N. T., Shannon P., Xu Z. Z. Extracellular calcium is involved in egg yolk-induced head-to-head agglutination of bull sperm // Theriogenology. 2012. V. 78. No. 7. Pp. 1476-1486.
