Russian Federation
Russian Federation
Opredelen leykocitarnyy profil' (leykoformula) po mazkam iz cel'noy krovi okrashennyh po Pappengeymu u chetyreh vidov ryb – karasya (Carassius) (n = 10), pelyadi (Coregonus peled) (n = 10), plotvy (Rutilus rutilus) (n = 5) i okunya (Perca fluviatilis) (n = 5) v ozerah Chelyabinskoy oblasti, imeyuschih rybohozyaystvennoe znachenie, Mayan, Kurakli-Mayan i Sugoyak. Individual'nye znacheniya pokazateley leykogrammy preobrazovyvali s ispol'zovaniem fi-preobrazovaniya arksinusa, vychislyali srednee i 95 % DI kak dlya kolichestvennyh priznakov, a poluchennye rezul'taty retransformirovali v ishodnuyu shkalu s pomosch'yu obratnogo preobrazovaniya. Raschety i graficheskie postroeniya vypolneny v paketah PAST (version 3.20) i KyPlot (version 2.15). Vypolnennaya veterinarno-sanitarnaya ekspertiza obsleduemyh grupp ryby pokazala sootvetstvie izuchennyh obrazcov normativno-pravovym dokumentam. Ryba iz vseh obsleduemyh ozer po rezul'tatam klinicheskogo osmotra po anamnezu zhizni (Anamnesis vitae) sootvetstvovala sostoyaniyu zdorovogo organizma. V celom poluchennye rezul'taty sootvetstvovali normativnym dannym i obuslovleny biologicheskimi osobennostyami ryby, tipom pitaniya zhivotnyh. V leykoformule vseh izuchennyh grupp ryb naibol'shee kolichestvo bylo predstavleno limfocitami (bolee 80 %) i neytrofilami (ot 15–20 % v krovi okunya iz ozera Sugoyak). Bolee 30 % soderzhaniya neytrofilov v leykocitarnom profile imeli karasi i pelyad' iz ozer Mayan i Kurakli-Mayan. Odnako v procentnom sootnoshenii sravnitel'no maksimal'no preobladali limfocity v krovi okunya iz ozera Sugoyak – do 80 %. Poluchennye rezul'taty imeyut poiskovyy harakter i yavlyayutsya osnovoy dlya provedeniya dal'neyshih rabot po izyskaniyu markernyh pokazateley ekologicheskogo i fiziologicheskogo sostoyaniya biologicheskih resursov v vodoemah, imeyuschih hozyaystvennoe znachenie.
rybohozyaystvennye vodoemy, leykocitarnyy profil', limfocity, neytrofily, ryba.
Постановка проблемы (Introduction)
Южный Урал характеризуется обилием водоемов с различными гидрохимическими режимами. Челябинская область имеет существенное рыбохозяйственное значение в регионе за счет наличия благоприятных для рыбопромысловой отрасли озер [11–14]. Вместе с тем регион имеет существенную техногенную нагрузку [6, 8, 13, 14]. Конечно, современные природосберегающие технологии в промышленном и прежде всего металлургическом производстве, обеспеченные «умными» фильтрами, способны минимизировать выбросы химических форм поллютантов, в том числе тяжелых металлов. Однако многолетнее наследие горнодобывающей промышленности открытого типа и неадсорбентное металлургическое производство отражаются на природных объектах в совокупности с существенными биогеохимическими провинциями на территории Южного Урала [6, 8, 11–14], влияют на физиологические процессы организма в процессе жизнедеятельности [2, 4, 5, 7, 11].
Физиологическое и клиническое значение микро- и макроэлементов хорошо известно. Многие микроэлементы являются структурообразующими в коферментах энзимов в организме животных и человека [9]. Как избыток, так и недостаток данных эссенциальных элементов за счет синергетических и антагонистических ионно-обменных механизмов, изучаемых в Уральском регионе еще А. А. Кабышем, Г. П. Грибовским и другими авторами, сказывается на стабильности усвоения ионов железа в синтезе гемоглобина крови, реактивности провоспалительных систем организма [2, 5, 9].
На морфофизиологическом уровне в системе крови тенденции концентраций микроэлементов отражаются в реактивности лейкоцитов [2, 5, 9]. В частности, гранулярные лейкоциты – нейтрофилы, эозинофилы и базофилы – могут отражать тенденции в изменениях внутренней среды под влиянием кратковременных, но обычно интенсивных нагрузок, проявляющихся в аллергических реакциях [4]. Тогда как агранулоциты – лимфоциты и моноциты – являются маркерами хронического воздействия на организм животных и человека. Это обусловлено длительными сроками циркуляции агранулярных клеток белой крови от нескольких недель до десятилетий. Поэтому лейкоцитарный профиль крови имеет важное диагностическое значение в характеристике воздействий микроэлементов на процессы внутренней среды организма, реализации витальных функций животных [2, 5, 17].
В связи с этим целью работы явилась диагностическая характеристика лейкоцитарного профиля рыбы из некоторых промысловых озер Челябинской области.
Методология и методы исследования (Methods)
Работа выполнена в рамках Государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации по теме № 0773-2018-0006 «Разработать методы и средства снижения негативного воздействия экотоксикантов на организм сельскохозяйственных животных на территориях экологического загрязнения зоны Южного Урала».
Отлов рыбы проводился в июле – августе 2018 года на трех озерах в северо-восточной части Челябинской области, имеющих рыбохозяйственное значение: Маяне, Куракли-Маяне и Сугояке. Лейкоцитарный профиль определялся на микроскопе BIOLAR PZO (Польша) по мазкам из цельной крови, окрашенным по Паппенгейму [4, 15, 16]. Всего были изучены 4 вида рыб: карась (Carassius) (n = 10), пелядь (Coregonus peled) (n = 10), плотва (Rutilus rutilus) (n = 5) и окунь (Perca fluviatilis) (n = 5).
В ходе статистического анализа использовали методы описательной статистики, выборочных сравнений и многомерный анализ [1, 10].
Индивидуальные значения показателей лейкограммы трансформировали с использованием фи-преобразования арксинуса, вычисляли среднее с 95-процентным доверительным интервалом (95 % ДИ), а полученные результаты ретрансформировали в исходную шкалу (в процентах) с помощью обратного преобразования. Многомерный анализ проводили методом анализа главных компонент (principal component analysis – PCA) после предварительного пересчета исходных композиционных данных в открытый формат с помощью центрированного преобразование логарифма отношения (centered log ratio transformation – clr). Полученные в ходе PCA индивидуальные значения меток компонент использовали в однофакторном дисперсионном анализе с последующими апостериорными сравнениями методом Тьюки. Расчеты выполнены в пакетах CoDaPack (version 2.02.21) [18] и PAST (version 3.20) [19].
Результаты (Results)
Выполненная ветеринарно-санитарная экспертиза обследуемых групп рыбы показала соответствие изученных образцов нормативно-правовым документам. По результатам клинического осмотра анамнез жизни (Anamnesis vitae) соответствовал состоянию здорового организма [2, 4, 5].
Рыбы (Pisces) как систематическая группа относятся к животным с лимфоидным типом кроветворения, то есть с преобладанием в клеточном составе белых клеток крови – лимфоцитов [4, 5, 7], что также отразилось в полученных результатах по лейкоформуле крови рыб (см. таблицу и рис. 1).
Таблица
Лейкограмма рыб из трех водоемов Челябинской области в 2018 году. Относительная частота клеток в процентах (95 % ДИ)
|
Вид
|
Лимфоциты
|
Нейтрофилы сегментоядерные |
Нейтрофилы палочкоядерные |
Моноциты
|
|
Озеро Маян |
||||
|
Пелядь (n = 10) |
65,2 [59,2; 70,8] |
24,8 [19,9; 30,3] |
0,08 [0,00; 0,30] |
8,7 [5,8; 11,9] |
|
Карась (n = 10) |
75,6 71,9; 79,3 |
16,9 14,4; 19,5 |
0,06 0,00; 0,23 |
6,9 4,9; 9,1 |
|
Озеро Куракли-Маян |
||||
|
Карась (n = 10) |
67,9 [63,2; 72,5] |
24,9 [21,2; 29,0] |
0,11 [0,00; 0,46] |
7,2 [4,4; 10,3] |
|
Озеро Сугояк |
||||
|
Плотва (n = 5) |
80,7 [7,6; 83,4] |
15,1 [12,6; 17,4] |
0,00 [–] |
4,1 [3,4; 4,8] |
|
Окунь (n = 5) |
79,7 [76,7; 82,0] |
16,0 [12,9; 19,1] |
0,08 [0,00; 0,32] |
3,7 [2,7; 4,4] |
Примечание: эозинофилы и базофилы во всех изученных образцах отсутствовали.
Table
Leukogram of fish from three reservoirs of the Chelyabinsk region in 2018. The relative frequency of cells in percent [95 % CI]
|
Species |
Lymphocytes |
Segmented-nuclear neutrophils |
Rod nuclear neutrophils |
Monocytes |
|
Lake Mayan |
||||
|
Coregonus peled (n = 10) |
65,2 [59,2; 70,8] |
24,8 [19,9; 30,3] |
0,08 [0,00; 0,30] |
8,7 [5,8; 11,9] |
|
Carassius (n = 10) |
75,6 71,9; 79,3 |
16,9 14,4; 19,5 |
0,06 0,00; 0,23 |
6,9 4,9; 9,1 |
|
Lake Kurakli-Mayan |
||||
|
Carassius (n = 10) |
67,9 [63,2; 72,5] |
24,9 [21,2; 29,0] |
0,11 [0,00; 0,46] |
7,2 [4,4; 10,3] |
|
Lake Sugoyak |
||||
|
Rutilus rutilus (n = 5) |
80,7 [7,6; 83,4] |
15,1 [12,6; 17,4] |
0,00 [–] |
4,1 [3,4; 4,8] |
|
Perca fluviatilis (n = 5) |
79,7 [76,7; 82,0] |
16,0 [12,9; 19,1] |
0,08 [0,00; 0,32] |
3,7 [2,7; 4,4] |
Note: eosinophils and basophils in all studied samples were absent.
Рис. 1. Лейкограммы крови рыб трех водоемов Челябинской области в 2018 году
Fig. 1. Leukograms of blood of fish from three reservoirs of the Chelyabinsk region in 2018
В лейкограммах всех выборок преобладали лимфоциты, на втором месте были сегментоядерные нейтрофилы, на третьем – моноциты. Изредка встречались палочкоядерные нейтрофилы, а эозинофилы и базофилы отсутствовали. В целом полученные результаты соответствуют нормативным данным и обусловлены биологическими особенностями рыбы, типом питания животных [2, 4, 5, 7].
|
|
|
Рис. 2. Преобразованные доли палочкоядерных (Band. Neu) и сегментоядерных (Seg. Neu) нейтрофилов, лимфоцитов (Lym) и моноцитов (Mon) крови рыб в пространстве двух первых главных компонент Fig. 2. Transformed shares of stab-core (Band. Neu) and segment-nuclear (Seg. Neu) neutrophils, lymphocytes (Lym) and monocytes (Mon) of fish blood in the space of the first two main components |
Для выявления наиболее общих закономерностей соотношения лейкоцитов использовали PCA, но с учетом композиционного характера данных. Поскольку все элементы лейкограммы составляют в сумме 100 %, данные показатели не являются независимыми: увеличение доли одного типа клеток в композиции неизбежно сопровождается уменьшением доли других типов. В результате этого традиционные методы анализа корреляций, а также основанные на них многомерные техники типа PCA дают искаженные результаты и могут приводить к неверным выводам. Для работы с такими данными предложены и активно используются (в первую очередь геологами) специальные преобразования, позволяющие «развернуть» закрытые в композиции значения и сделать их похожими на обычные некомпозиционные данные. Нами было использовано clr-преобразование из пакета CoDaPack [18].
Первая главная компонента (PC 1) объясняла 51,4 % общей изменчивости (дисперсии) данных лейкограмм. Как видно из ординационной диаграммы на рис. 2, она отражала преимущественно соотношение (отрицательная связь) между незрелыми палочкоядерными и зрелыми сегментоядерными формами нейтрофилов.
Известно, что увеличение доли незрелых нейтрофилов полиэтиологично и может являться результатом воспаления, инфекции, интоксикации, физического перенапряжения и др. [4, 7]. Частота таких клеток была крайне низка во всех выборках (см. таблицу). В ходе дисперсионного анализа, проведенного на рассчитанных индивидуальных метках PC 1, различий по рассматриваемому соотношению элементов крови между рыбами из изученных водоемов обнаружено не было: F(4; 35) = 0,20; Р = 0,938.
Вторая главная компонента (PC 2) объясняла 28,9 % общей дисперсии данных. Из рис. 2 видно, что она практически не затрагивала соотношения нейтрофилов, а отражала соотношение между лимфоцитами и моноцитами (отрицательная связь). Как показал дисперсионный анализ, различия между выборками рыб по PC 2 были высоко статистически значимыми: F(4; 35) = 4,21; Р = 0,007. Наибольший вклад в эти различия внесли пары: карась озера Маян и плотва озера Сугояк (Р = 0,013), карась озера Маян и окунь озера Сугояк (Р = 0,046), а также карась озера Куракли-Маян и плотва озера Сугояк (Р = 0,071). Третья компонента вобрала в себя остаточную изменчивость (19,7 %) и отражала соотношение между сегментоядерными нейтрофилами, с одной стороны, и лимфоцитами с моноцитами – с другой. По PC 3 наблюдалась тенденция к различиям (F(4; 35) = 2,58; Р = 0,054) за счет более высокого значения в карасе из озера Куракли-Маян.
Таким образом, главной особенностью полученных данных является неслучайно более высокая доля лимфоцитов и менее высокая – моноцитов в рыбах озера Сугояк.
Действительно, как видно из таблицы, у рыб озера Сугояк доля лимфоцитов достигала 80 % и более. Следует признать, что прямое сравнение рыб из разных водоемов не вполне корректно, поскольку рыбы принадлежали к разным видам. Тем не менее, важно отметить, что озеро Сугояк испытывает наибольшую из трех водоемов антропогенную нагрузку, являющуюся результатом его рекреационного использования и плотной застройки водосборной площади коттеджами. На это указывают уровни накопления в костной и особенно в мышечной тканях рыб озера Сугояк ряда тяжелых металлов (Mn, Fe, Co, Ni, Zn, Pb), чему будет посвящена отдельная публикация.
Обсуждение и выводы (Discussion and Conclusion)
Был изучен лейкоцитарный профиль у четырех видов промысловой рыбы из трех озер хозяйственного значения в условиях Челябинской области.
Установлено маркерное наибольшее (около 80 %) содержание лимфоцитов в крови рыб озера Сугояк, испытывающего наибольшую антропогенную нагрузку.
Полученные результаты имеют поисковый характер и являются основой для проведения дальнейших работ по изысканию маркерных показателей экологического и физиологического состояния биологических ресурсов в водоемах, имеющих хозяйственное значение.
1. Andreeva S. V., Khaydarshina N. E., Nokhrin D. Yu. Ispol’zovaniye statisticheskikh metodov v analize dinamiki vidovoy struktury mikrobnykh soobshchestv pri ozhogovoy travme [Use of statistical methods in analyzing the dynamics of the species structure of microbial communities in a burn injury] // Laboratory Service. 2019. Vol. 8. No. 1. Pp. 65-72. (In Russian.) DOI: https://doi.org/10.17116/labs2019801165; EDN: https://elibrary.ru/PGXGVT
2. Akhmetova V.V., Basina S. B. Otsenka morfologicheskoy i biokhimicheskoy kartiny krovi karpovykh ryb, vyrashchivayemykh v OOO „Rybkhoz“ Ul’yanovskogo rayona Ul’yanovskoy oblasti [Evaluation of the morphological and biochemical blood picture of carp fish grown in the „Rybhoz“ LLC of the Ulyanovsk district of the Ulyanovsk region] // Vestnik of the Ulyanovsk State Agricultural Academy. 2015. No. 3 (31). Pp. 53-58. Doi:https://doi.org/10.18286/1816-4501-2015-3-53-58. (In Russian.) EDN: https://elibrary.ru/UMIAYZ
3. Bespamyatnykh E. N., Krivonogova A. S., Donnik I. M., Isaeva A. G. Podkhody k korrektsii immunobiologicheskogo profilya zhivotnykh [Approaches to the correction of the immunobiological profile of animals] // Veterinaria Kubani. 2018. No. 5. Pp. 10-13. (In Russian.) EDN: https://elibrary.ru/YMJYYX
4. Bolezni ryb. Gematologicheskoye issledovaniye [Diseases of fish. Hematological research] [e-resource]. 2018. URL: http://arktikfish.com/index.php/bolezni-ryb/149-gematologicheskoe-issledovanie (date of reference: 17.06.2018). (In Russian.)
5. Vlasov V. A., Maslova N. I., Servetnik G. E. [Morfofiziologicheskaya kharakteristika matochnogo pogolov’ya rastitel’noyadnykh ryb rybkhoza „Ergeninskiy“] Morphological and physiological characteristics of the breeding stock of herbivorous fish from the „Ergeninskiy“ fish farm // Prirodoobustroystvo. 2017. Vol. 2. Pp. 120-127. (In Russian.) EDN: https://elibrary.ru/YQZMJN
6. Donnik I. M., Shkuratova I. A. Molekulyarno-geneticheskiye i immunobiokhimicheskiye markery otsenki zdorov’ya sel’skokhozyaystvennykh zhivotnykh [Molecular genetic and immunobiochemical markers of the health assessment of agricultural animals] // Herald of the Russian Academy of Sciences. 2017. T. 87. No. 4. Pp. 362-366. (In Russian.) DOI: https://doi.org/10.7868/S0869587317040132; EDN: https://elibrary.ru/YSECUB
7. Koroleva I. M. Gematologicheskiye pokazateli sigovykh ryb v vodoyemakh Kol’skogo severa v usloviyakh antropogennoy nagruzki [Hematological indicators of whitefish in the waters of the Kola North under conditions of anthropogenic load] // Problemy patologii, immunologii i okhrany zdorov’ya ryb i drugikh gidrobiontov: rasshirennyye materialy IV Mezhdunarodnoy konferentsii. Borok, 2015. Pp. 32-39. (In Russian.)
8. Krasnoperova E. A. Analiz soderzhaniya ekotoksikantov v myshechnoy tkani ryb razlichnykh semeystv [Analysis of the Content of Ecotoxicants in the Muscle Tissue of Fish of Different Families] // Sostoyaniye i puti razvitiya akvakul’tury v rossiyskoy federatsii v svete importozameshcheniya i obespecheniya prodovol’stvennoy bezopasnosti strany: materialy II natsional’noy nauchno-prakticheskoy konferentsii. Saint-Petersburg, 2017. Pp. 62-67. (In Russian.) EDN: https://elibrary.ru/ZQYTQJ
9. Kravchenko O. A., Maksin V. I. Osobennosti povedeniya i akkumulyatsii nanoakvatsitratov medi i tsinka v gidroekosistemakh [Peculiarities of behavior and accumulation of copper and zinc nano-aquacitrates in hydro-ecosystems] // Trace Elements in Medicine. 2016. T. 17. No. 4. Pp. 44-48. (In Russian.) DOI: https://doi.org/10.19112/2413-6174-2016-17-4-44-48; EDN: https://elibrary.ru/ZHKOUD
10. Medical statistics [Meditsinskaya statistika] [e-resource]. 2019. URL: http://medstatistic.ru/calculators.html (date of reference: 07.10.2019). (In Russian.)
11. Nokhrin D. Yu., Gribovsky Yu. G., Davydova N. A. Korrelyatsionnaya adaptometriya mikroelementnogo sostava tkaney kak metod otsenki sredovogo stressa (na primere populyatsiy promyslovykh ryb mineralizovannogo vodoyema) [Correlation adaptometry of the microelemental composition of tissues as a method for assessing environmental stress (using the example of populations of commercial fish of a mineralized body of water)] // Issues of Legal Regulation in Veterinary Medicine. 2018. No. 4. Pp. 252-255. (In Russian.) DOI: https://doi.org/10.17238/issn2072-6023.2018.4.252; EDN: https://elibrary.ru/YPXFDN
12. Nokhrin D. Yu., Gribovsky Yu. G., Davydova N. A. Sravnitel’naya otsenka presnovodnykh vodoyemov chelyabinskoy oblasti po soderzhaniyu tyazhelykh metallov v rybe [Comparative assessment of freshwater bodies of the Chelyabinsk region on the content of heavy metals in fish] // Agrarian Bulletin of the Urals. 2018. No. 10 (177). Pp. 35-40. (In Russian.) EDN: https://elibrary.ru/YQNFOX
13. Chuprakova A. M., Rebezov M. B. Analiz rezul’tatov monitoringa prob myasnykh i rybnykh produktov na soderzhaniye tyazhelykh metallov [Analysis of the results of monitoring samples of meat and fish products for heavy metals] // Bulletin of the South Ural State University. Series: Economics and Management. 2015. Vol. 9. No. 2. Pp. 194-201. (In Russian.) EDN: https://elibrary.ru/TYIFJT
14. Yudin M. F., Tairova A. R., Krasnoperova E. A. Osobennosti nakopleniya i raspredeleniya tyazhelykh metallov v sisteme „voda - donnyye otlozheniya - gidrobionty“ [Features of accumulation and distribution of heavy metals in the system „water - bottom sediments - hydrobionts“]. Troitsk: South Ural State Agrarian University, 2014. 214 p. (In Russian.)
15. Markaki Y., Harz H. (Eds.). Light Microscopy. Methods and protocols. Series: Methods in molecular biology. New York: Humana Press, 2017. 285 p. DOI:https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6810-7.
16. Mulisch M., Welsch U. (Eds.). Romeis Mikroskopische Technik. 19. Auflage. Berlin, Heidelberg: Springer Spektrum, 2015. 611 p. DOI:https://doi.org/10.1007/978-3-642-55190-1.
17. Sheshachalam A., Srivastava N., Mitchell T., Lacy P., Eitzen G. Granule protein processing and regulated secretion in neutrophils // Frontiers in immunology. 2014. V. 5. No 448. Pp. 1-11. PubMed ID: 25285096. DOI:https://doi.org/10.3389/fimmu.2014.00448. EDN: https://elibrary.ru/UOQJWD
18. Thio-Henestrosa, S., Comas M. CoDaPack v2 USER’s GUIDE [e-resource]. 2016. URL: http://ima.udg.edu/codapack/assets/codapack-manual.pdf (access date: 10.07.2019).
19. Yu H., Kim J., Lee C. Nutrient removal and microalgal biomass production from diferent anaerobic digestion efuents with Chlorella species // Scientific Reports. 2019. 9:6123. Pp. 1-13. DOI:https://doi.org/10.1038/s41598-019-42521-2.
