Abstract. The aim of study was to detect the fungal and mycotoxins contamination of grain samples of oat, wheat and barley grown in four regions of Ural region (Kurgan, Sverdlovsk, Tyumen, Chelyabinsk) in 2017–2018. Methods. The infection of grain with fungi was analyzed using traditional mycological methods; the content of fungal DNA was determined by quantitative PCR; the presence and amounts of toxic secondary metabolites of fungi in the grain was detected by high performance liquid chromatography with mass spectrometry. Results. In the analyzed grain samples at least 10 species of Fusarium fungi were identified, among which F. sporotrichioides, F. avenaceum sensu lato and F. poae were found to be prevailing. The areas of Fusarium species that are atypical for the territory of Ural region were specified. F. graminearum was found in 14 % of the analyzed grain samples, and F. langsethiae was detected in three grain samples from the Sverdlovsk region. The DNA of F. poae was found in 48 % of grain samples, F. avenaceum DNA – in 39 %, F. sporotrichioides DNA – in 30 %, and F. graminearum DNA – in 29 % of analyzed grain samples. The content of mycotoxins in the grain samples ranged significantly depending on the crop and the geographical origin of the samples. One to seven mycotoxins were present in each contaminated grain sample. T-2 and HT-2 toxins were most common and were detected in 59 % of samples. Following to them beauvericin and deoxynivalenol were found in 34 % and 25 % of the grain samples, respectively. The excess of the maximum permissible level of T-2 toxin in 26 times was detected in grain of barley from the Chelyabinsk region Scientific novelty. For the first time, the information about the occurrence and the amounts of moniliformin and beauvericin, which are rarely analyzed in the grain, is provided. The significant connection between the content of DNA of dominant Fusarium species and the amount of the main mycotoxins produced by them in the grain were revealed.
cereals, Fusarium, infection, DNA, quantitative PCR, mycotoxins, HPLC-MS/MS.
Постановка проблемы (Introduction)
Производство зерновых культур, которые занимают в структуре посевных площадей наибольший удельный вес (около 63 %), является важной отраслью сельского хозяйства Уральского региона. Качество выращиваемого зерна определяется набором критериев, важнейшим из которых является его микотоксикологическая чистота.
В зерне сельскохозяйственных культур обитают микроскопические грибы, относящиеся к различным таксономическим группам, которые успешно выживают и существуют в часто контрастных природно-экологических условиях. Среди них одними из основных представителей микобиоты зерновых культур являются грибы Fusarium Link, которые оказывают существенное влияние на урожайность и качество зерна.
Интерес к фузариозу зерна в Уральском регионе связан с тем, что данная территория навсегда вошла в историю мировой микотоксикологии из-за массового выявления заболевания людей и животных алиментарно-токсической алейкией или септической ангиной (АТА) в 1930–1940 гг. Особо тяжелые случаи были зарегистрированы в Оренбургской области (ранее Чкаловская), Свердловской области, Башкирии, Алтайском крае и др., где констатировали массовую гибель людей и животных в результате отравлений от употребляемого в пищу плесневелого или перезимовавшего на неубранных полях зерна [1, c. 27]. Микологический анализ 107 образцов перезимовавших злаков выявил свыше 83 видов грибов, среди которых доминировали грибы Fusarium, зараженность зерна пшеницы которыми достигала 43 %. Причиной микотоксикоза являлся гриб F. sporotrichioides Sherb., доля которого в составе микобиоты не превышала 8,5 % [1, c. 48]. Однако данный гриб продуцирует Т-2 и НТ-2 токсины, которые являются одними из наиболее опасных для теплокровных организмов [2, с. 43]. Более поздние исследования токсикологической чистоты зерна, выращенного в Уральском регионе, неоднократно выявляли его загрязнение Т-2 токсином, а также другими микотоксинами, образуемыми грибами Fusarium [3, с. 4], [4, с. 84].
Исследования видового состава грибов рода Fusarium, встречающихся на зерновых культурах в Уральском регионе, показывает наличие и достаточную изученность проблемы зараженности зерна. Микологический анализ 445 зерновых проб из Уральского региона (1985–2002 гг.) позволил установить, что доминирующими видами являются F. poae (Peck) Wollenw. и F. avenaceum (Fr.) Sacc. [5, с. 279]. Анализ 60 проб сена и соломы из Челябинской области выявил присутствие в них не менее шести видов фузариевых грибов, и в 90 % проб F. sporotrichioides был обнаружен либо как единственный вид, либо вместе с другими, но, как правило, он преобладал [6, с. 940]. Среди доминирующих видов рода Fusarium в зерне ячменя из Восточного Зауралья были также отмечены F. sporotrichioides, F. poae, F. culmorum (W. G. Sm.) Sacc., комплекс видов F. oxysporum Schltdl., F. equiseti (Corda) Sacc., из которых F. sporotrichioides был наиболее распространенным [7, с. 37]. В период 2012–2018 гг. ежегодный анализ фитосанитарного состояния семян яровой пшеницы методом влажных рулонов показал, что все партии зерна инфицированы грибами Fusarium, и зараженность отдельных партий составляла 60–70 % [8, с. 21]. Видовой состав Fusarium в порядке убывания частоты встречаемости был представлен: F. sporotrichioides, F. poae, F. equiseti, F. oxysporum, F. culmorum, F. solani (Mart.) Sacc., F. avenaceum и др.
Видовая идентификация грибов Fusarium в отсутствие четких морфологических границ признаков между видами представляет сложную задачу. Внедрение методов молекулярно-генетического анализа, таких как количественная ПЦР (кПЦР), не только значительно упрощает и повышает скорость анализа инфицированности зерна, но и позволяет проводить объективное сравнение представленности в зерне разных видов грибов по их биомассе, выраженной через содержание ДНК [9, с. 84], [10, с. 463], [11, с. 990]. В последние годы данный метод начал активно внедряться в мониторинговые исследования, проводимые на территории нашей страны [3, с. 10], [12, с. 19].
Анализируя видовой состав микобиоты зерна, можно прогнозировать присутствие определенных микотоксинов, поскольку токсинообразование у грибов имеет четко выраженный видоспецифичный характер [13, с. 76]. К наиболее опасным вредоносным видам рода Fusarium, влияющим как на семенные качества, так и на пищевые/кормовые качества зерна, относят F. avenaceum, F. graminearum Schwabe, F. culmorum, F. sporotrichioides, F. langsethiae Torp & Nirenberg, F. poae, F. tricinctum (Corda) Sacc.
Зерно, зараженное токсинопродуцирующими грибами, обязательно должно проверяться на загрязнение микотоксинами. В России, согласно нормативным документам, установлены предельно допустимые количества (ПДК) для микотоксинов, образуемых грибами Fusarium. В продовольственном зерне содержание Т-2 токсина не должно превышать 100 мкг/кг, ДОН – 700–1000 мкг/кг, ЗЕН – 200–1000 мкг/кг, а фумонизина (только для зерна сырой кукурузы на пищевые цели) – 4000 мкг/кг[1].
Исследование качества зерна и кормов в Уральском регионе выявило контаминацию 47 % образцов микотоксинами грибов Fusarium в 2007 г. и 31 % образцов – в 2008 г. [14, с. 89]. По данным других исследователей, средняя частота обнаружения Т-2 токсина в зерне составила 36,3 % при наиболее широком распространении в Челябинской (69,4 %), Свердловской (46,2 %) и Курганской областях (49,0 %). Анализ загрязненности микотоксинами образцов фуражного зерна в 2002–2006 гг. из отдельных областей Уральского региона выявил, что Т-2 токсин встречался в 70 % образцов в количествах 10–100 мкг/кг, один образец из Курганской области оказался положительным по ДОН (730 мкг/кг), а ЗЕН в образцах отсутствовал; также было показано, что овес подвержен контаминации Т-2 токсином в большей степени, чем другие зерновые культуры [4, с. 84].
Большинство мониторинговых исследований по определению загрязненности зерна микотоксинами проводят с помощью иммуноферментного анализа, который имеет ограничения по числу выявляемых метаболитов. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) позволяет получить информацию о широком спектре метаболитов, но из-за дороговизны оборудования и аналитических стандартов ограниченно используется для скрининга микотоксинов в растительных образцах.
Цель исследования – выявление зараженности грибами Fusarium и контаминации микотоксинами зерна, полученного в 2017–2018 г. из четырех областях Зауралья.
Методология и методы исследования (Methods)
Материалом для исследований являлись 56 образцов зерна урожая 2017–2018 гг., из которых 36 – зерно яровой пшеницы, 14 – ячменя, 5 − овса. Средние образцы зерна были получены из Щучанского района Курганской области (2 шт.), Исетского района Тюменской области (4 шт.), трех районов (Алапаевского, Белоярского и Пышминского) Свердловской области (11 шт.) и 10 районов (Варненского, Октябрьского, Чесменского, Еткульского, Кизильского, Красноармейского, Сосновского, Троицкого, Уйского, Чебаркульского) Челябинской области (39 шт.).
Оценку зараженности грибами и определение всхожести зерна проводили по описанным ранее методикам, а таксономическую принадлежность выросших микромицетов определяли по сумме макро- и микроморфологических признаков [13, с. 108–111]. Зараженность зерна определенным таксоном рассчитывали как отношение числа зерен, из которых были выделены грибы данного таксона, к общему числу анализируемых зерен, выраженное в процентах. Долю вида в комплексе видов Fusarium определяли как отношение числа зерен, зараженных определенным видом Fusarium к числу зерен, зараженных грибами Fusarium.
Зерно каждого образца (20 г) гомогенизировали в стерильных контейнерах на мельнице Tube Mill Control (IKA, Германия). Размолотую муку хранили при –20 °C.
Выделение ДНК из 200 мг зерновой муки, а также из активно растущего мицелия типовых штаммов Fusarium из коллекции лаборатории микологии и фитопатолгии ФГБНУ ВИЗР проводили с помощью набора для выделения геномной ДНК (Thermo Fisher Scientific, Литва) по протоколу производителя.
Концентрацию выделенной ДНК из муки и штаммов определяли, используя флуориметр Qubit 2.0 с набором реагентов Quant-iT dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, США). ДНК штаммов грибов разбавляли до концентрации 10 нг/мл и использовали для построения калибровочных кривых в десятикратных последовательных разведениях от 10–1 до 10–6 нг/мкл. ДНК из образцов муки разводили до концентрации в диапазоне 2–50 нг/мкл.
Содержание ДНК гриба F. sporotrichioides в зерновой муке определяли методом количественной ПЦР (кПЦР) с красителем SYBR Green, а содержание ДНК F. avenaceum sensu lato, F. graminearum и F. poae – методом кПЦР с пробами TaqMan [3, с. 10], [9, с. 81], [11, с. 988]. Амплификацию проводили на термоциклере CFX96 Real-Time System (BioRad, США), обработку первичных данных – с помощью программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager 1.6.
Количество ДНК грибов выражали в виде доли от общей ДНК, выделенной из зерновой муки (пг/нг общей ДНК, сокращенно – пг/нг). Нижний достоверный предел выявления содержания ДНК грибов в пробе общей ДНК, выделенной из образца муки, установлен на уровне 5×10–4 пг/нг.
Экстрагирование вторичных метаболитов грибов проводили, добавляя к 5 г навески зерновой муки 20 мл раствора ацетонитрила, воды, уксусной кислоты в соотношении 79:20:1. Детектирование и количественное определение микотоксинов выполняли методом высокоэффективной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) на комплексе оборудования, состоящего из масс-спектрометра AB SCIEX Triple Quad™ 5500 (Applied Biosystems, США), оснащенного источником ионизации с электрораспылением TurboV (ESI) и системой ВЭЖХ 1290 Agilent Infinity (Agilent Technologies, Германия), согласно методике ГОСТ[2]. Хроматографическое разделение проводили при 25 °С на колонке Gemini® C18, 150×4,6 мм (Phenomenex, США). Степень извлечения микотоксинов из зерна составляла от 79 до 105 %.
В экстрактах анализировали содержание 19 микотоксинов, образуемых грибами Fusarium: трихотеценовых микотоксинов (T-2 и HT-2 токсинов, T-2 триола, неосоланиола (НЕО), диацетоксисцирпенола (ДАС), ниваленола (НИВ), фузаренона-X, дезоксиниваленола (ДОН), ДОН-3-глюкозида, 3-ацетатДОН, 15-ацетатДОН), зеараленола (ЗЕН), α-ЗЕН и β-ЗЕН, фумонизинов В1, В2, и B3, монилиформина (МОН) и боверицина (БОВ).
Программу Microsoft Excel 2010 использовали для расчета средних значений, доверительного интервала при уровне значимости р < 0,05 и визуализации полученных результатов. В программе STATISTICA 10.0 проводили дисперсионный анализ данных и расчет корреляционных связей между признаками через линейный коэффициент Пирсона (r) при уровне значимости р < 0,05.
Результаты (Results)
Инфицированность зерна грибами Fusarium, их видовой состав. Грибы Fusarium выявлены в 100 % образцов зерна из Курганской (диапазон зараженности составил 2–12 %), Свердловской (6–47 %) и Тюменской (10–30 %) областей. Эти грибы также были обнаружены в большинстве образцов из Челябинской области (67 %), зараженность которых составляла от 1 до 23 %. Установлены различия средней зараженности грибами Fusarium зерна разных культур: в среднем зараженность зерна образцов овса и ячменя (10,4 ± 4,2 % и 9,7 ± 3,8 % соответственно) была выше по сравнению с зараженностью зерна пшеницы (5,6 ± 1,4 %). Независимо от типа зерновой культуры самая низкая зараженность грибами Fusarium отмечена в Челябинской области. Тогда как средняя зараженность грибами Fusarium образцов из Свердловской области была относительно высокой и варьировала в пределах 12,5–27,3 %, достигая 47 % (ячмень, Пышминский район).
Видовая идентификация изолятов Fusarium, выделенных из зерна, позволила выявить не менее 10 видов, из которых чаще остальных встречались F. sporotrichioides (61 % образцов), F. avenaceum sensu lato (45 %), F. poae (29 %) и F. tricinctum (21 %).
Выявленная максимальная зараженность зерна F. sporotrichioides составила 35 % (ячмень из Пышминского района Свердловской области), F. avenaceum sensu lato − 21 % (пшеница из Исетского района Тюменской области), F. poae – 19 % (пшеница из Пышминского района Свердловской области). Средняя зараженность зерна F. tricinctum не превышала 4 % (пшеница из Белоярского района Свердловской области).
Гриб F. graminearum выявлен в 14 % всех анализированных образцов, с наибольшей зараженностью 5 % зерна пшеницы из Челябинской области. Вид F. langsethiae найден только в Свердловской области в зерне двух образцов овса и пшеницы, а зараженность зерна этим видом составила 3 и 1 % соответственно. Также единично в образцах пшеницы были отмечены F. acuminatum Ellis & Everh., F. globosum Rheeder, Marasas & P.E. Nelson и F. semitectum Berk. & Ravenel, а в образцах ячменя − F. equiseti. Доли основных представителей грибов рода Fusarium приведены на рис. 1.
Рис. 1. Видовой состав грибов рода Fusarium, выявленных в зерне образцов из различных областей Зауралья, 2017–2018 гг.
Fig. 1. The species composition of Fusarium fungi detected in grain samples from Ural region, 2017–2018
Количество ДНК грибов Fusarium в зерне. ДНК F. avenaceum обнаружена в 39 % образцов, ДНК F. graminearum – в 29 %, ДНК F. poae – в 48 %, ДНК F. sporotrichioides – в 30 %. При этом по содержанию ДНК грибов Fusarium в зерне разных культур были выявлены различия (таблица 1). В образцах овса и ячменя чаще выявляли ДНК F. poae – в 80 % и 73 % образцов, реже F. avenaceum – в 60 и 47 % и F. graminearum – в 40 и 20 % соответственно. Частота обнаружения ДНК разных видов Fusarium в зерне пшеницы была сходной: ДНК F. sporotrichioides выявили в 39 % образцов, F. avenaceum и F. poae – в 33 %, а F. graminearum – в 31 %. Влияние вида зерновой культуры на количества ДНК грибов Fusarium было достоверным только в случае F. sporotrichioides.
Таблица 1
Содержание ДНК грибов Fusarium в образцах зерна из различных областей Зауралья, 2017–2018 гг.
|
Зерновая культура |
Область (число образцов) |
Процент зараженных образцов / диапазон количества ДНК гриба × 10–4, пг/нг |
|||
|
aven* |
gram |
poae |
spor |
||
|
Овес |
Свердловская (4) |
75 / 14,6–56,5 |
50 / 7,7; 8,2 |
75 / 30,2–378,0 |
0 |
|
Челябинская (1) |
0 |
0 |
41,8 |
0 |
|
|
В среднем по овсу |
19,3 ± 10,3 |
3,2 ± 1,9 |
164,7 ± 84,7 |
0 |
|
|
Пшеница |
Курганская (2) |
50 / 32,6 |
50 / 23,1 |
50 / 93,4 |
50 / 6,2 |
|
Свердловская (3) |
100 / 5,8–104,9 |
0 |
67 / 266,8; 680,9 |
33 / 30,8 |
|
|
Тюменская (4) |
100 / 13,2–137,3 |
75 / 5,7–59,4 |
25 / 8,4 |
100 / 151,9–379,3 |
|
|
Челябинская (27) |
15 / 7,5–11,2 |
26 / 6,7–2160,2 |
30 / 5,5–209,4 |
30 / 5,9–163,6 |
|
|
В среднем по пшенице |
13,5 ± 5,0 |
76,8 ± 59,1 |
41,0 ± 20,3 |
44,1 ± 13,5 |
|
|
Ячмень |
Свердловская (4) |
100 / 20,4–376,9 |
25 / 7,6 |
100 / 30,3–523,8 |
25 / 6,5 |
|
Челябинская (11) |
30 / 5,2–33,9 |
18 / 6,7; 30,1 |
64 / 29,5–433,6 |
18 / 17,8; 23,6 |
|
|
В среднем по ячменю |
34,1 ± 24,2 |
3,0 ± 2,0 |
129,8 ± 42,1 |
3,2 ± 1,9 |
|
Примечание: aven – Fusarium avenaceum; gram – F. graminearum; poae – F. poae; spor – F. sporotrichioides.
Table 1
The content of DNA of Fusarium fungi in grain samples from Ural region, 2017–2018
|
Cereals |
Region (the number of samples) |
Percentage of infected samples / the range of fungal DNA amounts ×10-4, pg/ng |
|||
|
aven |
gram |
poae |
spor |
||
|
Oats |
Sverdlovsk (4) |
75 / 14.6–56.5 |
50 / 7.7; 8.2 |
75 / 30.2–378.0 |
0 |
|
Chelyabinsk (1) |
0 |
0 |
41.8 |
0 |
|
|
Average in oats |
19.3 ± 10.3 |
3.2 ± 1.9 |
164.7 ± 84.7 |
0 |
|
|
Wheat |
Kurgan (2) |
50 / 32.6 |
50 / 23.1 |
50 / 93.4 |
50 / 6.2 |
|
Sverdlovsk (3) |
100 / 5.8–104.9 |
0 |
67 / 266.8; 680.9 |
33 / 30.8 |
|
|
Tyumen (4) |
100 / 13.2–137.3 |
75 / 5.7–59.4 |
25 / 8.4 |
100 / 151.9–379.3 |
|
|
Chelyabinsk (27) |
15 / 7.5–11.2 |
26 / 6.7–2160.2 |
30 / 5.5–209.4 |
30 / 5.9–163.6 |
|
|
Average in wheat |
13.5 ± 5.0 |
76.8 ± 59.1 |
41.0 ± 20.3 |
44.1 ± 13.5 |
|
|
Barley |
Sverdlovsk (4) |
100 / 20.4–376.9 |
25 / 7.6 |
100 / 30.3–523.8 |
25 / 6.5 |
|
Chelyabinsk (11) |
30 / 5.2–33.9 |
18 / 6.7; 30.1 |
64 / 29.5–433.6 |
18 / 17.8; 23.6 |
|
|
Average in barley |
34,1 ± 24.2 |
3.0 ± 2.0 |
129.8 ± 42.1 |
3.2 ± 1.9 |
|
Note: aven – Fusarium avenaceum; gram – F. graminearum; poae – F. poae; spor – F. sporotrichioides.
Распределение содержания ДНК видов Fusarium в зерне из разных областей также оказалось неравномерным. Влияние происхождения образцов на количества ДНК грибов в зерне было достоверным для F. sporotrichioides, F. avenaceum и F. poae. Высокие количества ДНК F. avenaceum выявлены в зерне ячменя из Свердловской области – в среднем (115,9 ± 85,3)×10–4 пг/нг, пшеницы из Тюменской области – (67,6 ± 25,2)×10–4 пг/нг. Высокие количества ДНК F. poae также обнаружены в зерне из Свердловской области – в среднем (195,5 ± 102,2)×10–4 пг/нг для овса, (315,9 ± 194,1)×10–4 пг/нг для пшеницы и (206,4 ± 106,7)×10–4 пг/нг для ячменя. Наименьшее содержание ДНК F. poae – в среднем (2,1 ± 2,1)×10–4 пг/нг – выявлено в зерне пшеницы из Тюменской области, но при этом среднее количество ДНК F. sporotrichioides в этих образцах было наибольшим – (223,7 ± 51,4)×10–4 пг/нг. Максимальное среднее количество ДНК F. graminearum обнаружено в зерне пшеницы из Челябинской области – (98,9 ± 78,7)×10–4 пг/нг, в то время как в зерне пшеницы из Свердловской области ДНК этого патогена не выявлено вовсе.
Количество вторичных метаболитов грибов Fusarium в зерне. Проведенный с помощью ВЭЖХ-МС/МС анализ показал отсутствие микотоксинов грибов рода Fusarium в зерне двух образцов ячменя из Уйского и Чебаркульского районов Челябинской области, а также в 28 % образцов зерна пшеницы из Курганской области и разных районов Челябинской области. Из 19 анализированных микотоксинов ни в одном из образцов не обнаружены фумонизины, фузаренон-X, α-ЗЕН и β-ЗЕН.
В 79 % образцов зерна встречались от одного до семи токсичных метаболитов. Максимальное число различных микотоксинов обнаружено в образце пшеницы из Тюменской области. В целом образцы из Тюменской и Свердловской областей характеризовались большим разнообразием выявленных микотоксинов: кроме трихотеценовых микотоксинов, в их зерне чаще обнаруживали МОН (27 и 75 % образцов соответственно) и БОВ (64 % и 75 %) по сравнению с образцами из двух других областей.
Сравнение загрязненности микотоксинами разных культур показало, что все 13 выявленных токсичных метаболитов встречались только в зерне образцов пшеницы, в образцах зерна овса и ячменя их разнообразие было ниже – 7 и 8 микотоксинов соответственно (рис. 2).
Рис. 2. Встречаемость микотоксинов грибов рода Fusarium в образцах зерна из Зауралья, 2017–2018 гг.
Fig. 2. The occurrence of mycotoxins produced by Fusarium fungi in grain samples from Ural region, 2017–2018
К редко встречаемым в зерне (не более 2–7 % загрязненных образцов) можно отнести трихотеценовые микотоксины группы А: ДАС (5,1 мкг/кг) и НЕО (3,1–15,2 мкг/кг); трихотеценовые микотоксины группы В: 3-АцДОН (28,8 мкг/кг), 15-АцДОН (15,9–24,5 мкг/кг) и ДОН-3-глюкозид (20,8–34,2 мкг/кг), а также ЗЕН (2,4 мкг/кг). Встречаемость и диапазоны содержания других семи микотоксинов, обнаруженных в образцах из различных областей Зауралья, приведены в таблице 2.
Наиболее распространенными микотоксинами являлись НТ-2 токсин (59 % загрязненных образцов), БОВ (34 %), Т-2 токсин и ДОН (по 25 %). Сравнение культур показало, что зерно овса было в большей степени контаминировано трихотеценовыми микотоксинами группы А по сравнению с зерном пшеницы и ячменя. Число загрязненных различными микотоксинами образцов в ряду овес – пшеница – ячмень было следующим (в %): НТ-2 токсин 100 – 53 – 60, Т-2 токсин 60 – 14 – 40, Т-2 триол 20 – 6 – 20, НИВ 40 – 14 – 27, МОН 20 – 11 – 13 и БОВ 60 – 25 – 47. В то же время ДОН в зерне овса не обнаружен, тогда как выявлен в 31 % образцов пшеницы и 20 % ячменя.
Из микотоксинов, имеющих установленные в России ПДК, превышение этого показателя было выявлено только в случае Т-2 токсина. В зерне ячменя из Сосновского района Челябинской области было выявлено 2651,5 мкг/кг, что превышает значение ПДК более чем в 26 раз. Количества НТ-2 токсина выше 100 мкг/кг были выявлены чаще: в образцах зерна овса и пшеницы из Свердловской области (109,5 и 147,6 мкг/кг), а также в зерне двух образцов пшеницы и двух ячменя из Челябинской области (129,2–481,3 мкг/кг). Максимальное содержание ДОН составило 413,6 мкг/кг в образце пшеницы из Исетского района Тюменской области, что почти в два раза ниже значения ПДК этого микотоксина.
Таблица 2
Количество микотоксинов грибов Fusarium в зерне образцов зерновых культур из Зауралья, 2017–2018 гг.
|
Зерновая культура |
Область (число образцов) |
Процент образцов загрязненных микотоксинами грибов Fusarium / диапазон количеств, мкг/кг |
||||||
|
Т-2 токсин |
НТ-2 токсин |
Т-2 триол |
НИВ |
ДОН |
МОН |
БОВ |
||
|
Овес |
Свердловская (4) |
50 / 5,6; 62,9 |
100 / 10,5–109,5 |
25 / 10,6 |
50 / 47,3; 110,8 |
0 |
25 / 16,9 |
50 / 23,8; 36,2 |
|
Челябинская (1) |
100 / 14,5 |
100 / 23,4 |
0 |
0 |
0 |
0 |
100 / 6,5 |
|
|
Пшеница |
Курганская (2) |
0 |
50 / 11,6 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Свердловская (3) |
67 / 17,7; 19,4 |
67 / 28,0; 147,6 |
33 / 11,6 |
67 / 32,6; 119,6 |
0 |
33 / 22,9 |
67 / 18,7; 49,3 |
|
|
Тюменская (4) |
25 / 9,3 |
100 / 14,2–63,6 |
0 |
25 / 9,5 |
100 / 8,1–413,6 |
75 / 47,4–112,5 |
75 / 3,5–5,3 |
|
|
Челябинская (27) |
7 / 18,2; 66,3 |
44 / 7,7–152,2 |
4 / 5,7 |
4 / 7,8 |
26 / 7,3–309,0 |
0 |
15 / 3,6–7,8 |
|
|
Ячмень |
Свердловская (4) |
75 / 5,9–32,3 |
100 / 13,2–95,3 |
25 / 34,6 |
50 / 9,6; 42,0 |
0 |
25 / 50,0 |
75 / 5,4–11,7 |
|
Челябинская (11) |
27 / 6,2–2651,5 |
45 / 5,8–481,3 |
18 / 21,9; 59,7 |
18 / 160,9; 194,3 |
27 / 18,2–43,7 |
9 / 6,9 |
36 / 4,1–30,7 |
|
[U1] Примечание: НИВ – ниваленол; ДОН – дезоксиниваленол; МОН – монилиформин; БОВ – боверицин.
Table 2
The amounts of mycotoxins produced by Fusarium fungi in grain samples from Ural region, 2017–2018
|
Cereal |
Region (the number of samples) |
The percentage of samples contaminated with Fusarium mycotoxins / The range of amount, ppb |
||||||
|
Т-2 toxin |
НТ-2 toxin |
Т-2 triol |
NIV* |
DON |
MON |
BEA |
||
|
Oats |
Sverdlovsk (4) |
50 / 5.6. 62.9 |
100 / 10.5–109.5 |
25 / 10.6 |
50 / 47.3; 110.8 |
0 |
25 / 16.9 |
50 / 23.8; 36.2 |
|
Chelyabinsk (1) |
100 / 14.5 |
100 / 23.4 |
0 |
0 |
0 |
0 |
100 / 6.5 |
|
|
Wheat |
Kurgan (2) |
0 |
50 / 11,6 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Sverdlovsk (3) |
67 / 17.7; 19.4 |
67 / 28.0; 147.6 |
33 / 11.6 |
67 / 32.6; 119.6 |
0 |
33 / 22.9 |
67 / 18.7; 49.3 |
|
|
Tyumen (4) |
25 / 9.3 |
100 / 14.2–63.6 |
0 |
25 / 9.5 |
100 / 8.1–413.6 |
75 / 47.4–112.5 |
75 / 3.5–5.3 |
|
|
Chelyabinsk (27) |
7 / 18.2; 66.3 |
44 / 7.7–152.2 |
4 / 5.7 |
4 / 7.8 |
26 / 7.3–309.0 |
0 |
15 / 3.6–7.8 |
|
|
Barley |
Sverdlovsk (4) |
75 / 5.9–32.3 |
100 / 13.2–95.3 |
25 / 34.6 |
50 / 9.6; 42.0 |
0 |
25 / 50.0 |
75 / 5.4–11.7 |
|
Chelyabinsk (11) |
27 / 6.2–2651.5 |
45 / 5.8–481.3 |
18 / 21.9; 59.7 |
18 / 160.9; 194.3 |
27 / 18.2–43.7 |
9 / 6.9 |
36 / 4.1–30.7 |
|
Note: NIV – nivalenol; DON – deoxynivalenol; MON – moniliformin; BEA – beauvericin.
Обсуждение и выводы (Discussion and Conclusion)
Микологический анализ зерна урожая 2017–2018 гг. из четырех областей Зауралья выявил, что в зерне 77 % образцов присутствовали грибы Fusarium, средняя зараженность которыми составила 9,3 ± 1,7 %. Полученные результаты показали, что за последние годы список доминирующих видов фузариевых грибов на зерновых культурах в этом регионе России не претерпел существенных изменений. Установлено присутствие в зерне не менее 10 видов Fusarium, из которых F. avenaceum, F. poae и F. sporotrichioides были наиболее представленными. В зерне овса доля F. poae составила 56 % от всех выделенных изолятов Fusarium, в зерне ячменя превалировал F. sporotrichioides с долей 59 %, а в зерне пшеницы доли F. sporotrichioides и F. avenaceum оказались равными – 37 и 36 % соответственно. Впервые в зерне пшеницы из Кизильского района Челябинской области выявлен вид F. globosum, единичные находки которого были отмечены ранее в Новосибирской области и Алтайском крае [15, с. 10].
Сочетания высокоточных аналитических методов, таких как кПЦР и ВЭЖХ-МС/МС, позволили выявить связи между первичными (ДНК) и вторичными метаболитами (микотоксины) грибов.
Основным продуцентом трихотеценовых микотоксинов группы А в зерне образцов являлся F. sporotrichioides. Между количествами его ДНК и микотоксинов − Т-2 и НТ-2 токсинов, Т-2 триола и НЕО – в зерне выявлена высокая достоверная связь (r = от +0,74 до +0,93). Одновременная контаминация зерна Т-2 токсином и его производным − НТ-2 токсином – также подтверждается существенной связью между их количествами (r = +0,93). При попадании в организм животного или человека Т-2 токсин превращается в НТ-2 токсин, таким образом, токсичность этих микотоксинов для потребителя считается одинаковой [16, с. 67]. Однако для НТ-2 токсина нет установленных ПДК, в отличие от Т-2 токсина, при этом НТ-2 токсин встречается в количествах более 100 мкг/кг чаще, чем Т-2 токсин, и правильнее было бы учитывать и регламентировать их суммарные количества. При таком подходе в нашем исследовании число образцов зерна, загрязненных этими двумя микотоксинами, составляет 73 %, в отличие от 25 % образцов, где выявлен только Т-2 токсин.
Кроме широко распространенного F. sporotrichioides, другой продуцент Т-2 и НТ-2 токсинов − F. langsethiae – выявлен в единичных образцах пшеницы и овса, в которых также наблюдалось превышение ПДК микотоксинов. Если в начале 2000-х его выявляли только в странах Северной Европы, то сейчас он стал типичным видом микобиоты зерновых культур на всей Европейской территории [17, с. 42]. До настоящего времени единичной находкой вида F. langsethiae за пределами Европы являлся штамм из Тюменской области, выделенный из овса в 2010 г. [18, с. 183]. Исходные семена овса для посева были получены из Краснодарского края, где F. langsethiae распространен. Этот гриб – новый заносной представитель микобиоты зерна в Уральском регионе, который, по всей видимости, распространился на новую территорию с семенами зерновых культур. Из-за фенотипических особенностей F. langsethiae, а также бессимптомности инфекционного процесса его выявление микологическим методом затруднено, и применение кПЦР является наиболее адекватным методом установления истинной зараженности зерна F. langsethiae [19, с. 174], [20, с. 129].
Филогенетически близкородственный к F. sporotrichioides и F. langsethiae вид F. poae является типичным представителем микобиоты зерна и основным продуцентом ДАС и НИВ. Содержание этих трихотеценовых микотоксинов в зерне не регламентируются, а свойства данных метаболитов находятся в стадии изучения [21, с. 251], [22, с. 8581–8582]. Высокая зараженность F. poae может приводить к содержанию в зерне значительных количеств НИВ, который предположительно играет важную роль в патогенезе F. poae [23, с. 749]. Результаты нашего исследования демонстрируют, что связь между количествами ДНК F. poae и НИВ в зерне была высокой и достоверной (r = +0,75). ДАС редко выявляют в зерне, в нашем исследовании он был выявлен единично, на пределе уровня детекции (5,1 мкг/кг) − в образце пшеницы с максимальной зараженностью зерна F. poae (19 %) и высоким количеством ДНК этого гриба (680,9 пг/нг).
Особого внимания заслуживает F. graminearum – один из самых агрессивных патогенов зерновых культур. Ранее сообщалось о единичном присутствии F. graminearum на территории Уральского региона [6, с. 940], но в то же время микотоксинов ДОН и ЗЕН, образуемых этим патогеном, в зерне не находили [4, с. 83]. Анализ образцов пшеницы из Челябинской области показал отсутствие в их зерне ДНК F. graminearum [3, с. 3]. Однако результаты нашего исследования свидетельствуют о массовом присутствии F. graminearum не только в Челябинской области, но и в других областях Зауралья. Между зараженностью зерна этим патогеном и его ДНК выявлена высокая положительная связь (r = +0,86). Установлена контаминация 25 % образцов ДОН и единично ЗЕН. Обнаружена взаимосвязь количества ДНК F. graminearum в зерне и содержания ДОН (r = +0,90), а также ЗЕН (r = +0,99), которая соответствует аналогичным показателям, выявленным в других регионах РФ на естественном инфекционном фоне патогена [24, с. 29].
Видам грибов Fusarium, продуцирующим не трихотеценовые микотоксины, как правило, уделяют меньше внимания, несмотря на их широкое распространение и зачастую доминирующее положение. Морфолого-культуральный анализ грибов, относящихся к F. avenaceum sensu lato, показал их существенное внутривидовое разнообразие. На наш взгляд, 20–22 % штаммов F. avenaceum sensu lato относились к группе близкородственных видов F. anguioides Sherb., F. arthrosporioides Sherb., F. diversisporum Sherb. и других. Отмечена приуроченность F. avenaceum и близкородственных видов к зерну ячменя [9, с. 84], [25, с. 39], [26, с. 40]. В нашей работе выявлена достоверно более высокая зараженность грибами F. avenaceum sensu lato зерна ячменя по сравнению с зерном других культур. Показано, что зараженность зерна F. avenaceum приводит к уменьшению длины проростка [27, с. 6], кроме того, этот гриб и близкородственные ему F. arthrosporioides и F. tricinctum оказывают влияние на кормовое и пищевое качество зерна, поскольку образуют микотоксины МОН и БОВ [28, с. 4–5]. Анализ содержания МОН в более 600 образцов различных кормов выявил, что из зерновых культур, выращенных в России, наиболее контаминированными были кукуруза (93 % образцов, максимальное выявленное количество МОН – 1431,2 мкг/кг) и ячмень (69 % образцов, 638,7 мкг/кг) [29, с. 66]. Основными неблагоприятными воздействиями МОН на здоровье потребителя являются кардиотоксичность и гематотоксичность [30, с. 5]. Полученные нами результаты установили присутствие МОН в 13 % образцов в количествах 6,9–112,5 мкг/кг. Основным продуцентом МОН в анализированных образцах является F. avenaceum sensu lato, между количествами его ДНК и МОН обнаружена достоверная связь (r = +0,66). В то же время выявленные количества БОВ были достоверно связаны с зараженностью зерна F. tricinctum (r = +0,60) и F. poae (r = +0,82), который также является одним из продуцентов этого микотоксина [23, с. 748], [31, с. 622]. В нашей работе БОВ обнаружен в 34 % образцов в количествах 3,5–49,3 мкг/кг. Выявленная степень загрязненности зерна этим микотоксином согласуется с информацией о встречаемости БОВ в зерне в странах Скандинавии − от 12 % до 100 % образцов, в основном в количествах ниже 100 мкг/кг [28, с. 2].
Фактические данные о загрязнении зерна микотоксинами грибов рода Fusarium отражают массовое распространение их продуцентов − F. avenaceum sensu lato, F. poae и F. sporotrichioides, на что также указывают достоверные связи между выявляемыми в зерне количествами ДНК этих грибов и образуемых ими микотоксинов. Впервые с помощью метода ВЭЖХ-МС/МС в зерне из Уральского региона определены 13 микотоксинов и их сочетаний, среди которых, как и прежде, особое значение имеют Т-2 и НТ-2 токсины. Совместная встречаемость этих микотоксинов выявлена в 59 % образцов с максимальным суммарным содержанием 3132,8 мкг/кг, которое превышает ПДК для Т-2 токсина в более чем 31 раз. Кроме того, на территории Свердловской области установлено распространение другого продуцента Т-2 и НТ-2 токсинов − F. langsethiae, что указывает на расширение ареала этого токсинопродуцирующего вида. Выявление во всех областях Зауралья еще одного нетипичного для региона представителя грибов Fusarium в микобиоте зерна − F. graminearum, а также образуемых им микотоксинов ДОН и ЗЕН свидетельствует о необходимости ежегодного микотоксикологического мониторинга качества получаемого урожая.
Благодарности (Acknowledgments)
Авторы благодарят сотрудников компании ООО «Сингента» и АО «Байер» за предоставленные образцы зерна. Исследование выполнено при финансовой поддержке РНФ (проект № 19-76-30005).
[1] Технический регламент Таможенного союза 015/2011 «О безопасности зерна» с изменениями на 15 сентября 2017 г. Приложение № 2.
Технический регламент Таможенного союза 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» с изменениями от 8 августа 2019 г. Приложение № 3.
[2] ГОСТ 34140-2017 Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые, корма, продовольственное сырье. Метод определения микотоксинов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. – М.: Стандартинформ, 2017. – 20 с.
[U1]Нет расшифровки аббревиатур
1. Sarkisov A. H. Perezimovavshie pod snegom zernovye kul'tury. M.: Izd-vo Ministerstva sel'skogo hozyaystva SSSR, 1948. 108 s.
2. Schuhmacher-Wolz U., Heine K., Schneider K. Report on toxicity data on trichothecene mycotoxins HT-2 and T-2 toxins // EFSA Supporting Publications. 2010. T. 7. No. 7. EN-65. DOI:https://doi.org/10.2903/sp.efsa.2010.EN-65.
3. Gagkaeva T., Gavrilova O., Orina A. [et al.] Analysis of toxigenic Fusarium species associated with wheat grain from three regions of Russia: Volga, Ural, and West Siberia // Toxins. 2019. T. 11. No. 5. P. 252. DOI:https://doi.org/10.3390/toxins11050252.
4. Kononenko G. P., Burkin A. A. O kontaminacii fuzariotoksinami zerna zlakov, ispol'zuemyh na kormovye celi // Sel'skohozyaystvennaya biologiya. 2009. № 4. S. 81-88.
5. Malinovskaya L. S., Piryazeva E. A., Kislyakova O. S. Vyyavlenie dominantnyh vidov roda Fusarium v zerne iz razlichnyh regionov RF // Uspehi medicinskoy mikologii: materialy Vtorogo vserossiyskogo kongressa po medicinskoy mikologii. Moskva, 2004. S. 278-280.
6. Piryazeva E. A., Kononenko G. P., Burkin A. A. Porazhennost' grubyh kormov toksinoobrazuyuschimi gribami roda Fusarium // Sel'skohozyaystvennaya biologiya. 2016. T. 51. № 6. S. 937-945. DOI:https://doi.org/10.15389/agrobiology.2016.6.937rus.
7. Kazakova O. A., Toropova E. Yu., Vorob'eva I. G. Taksonomicheskiy sostav mikromicetov na semenah yachmenya v Zapadnoy Sibiri i Zaural'e // Razvitie nauchnoy, tvorcheskoy i innovacionnoy deyatel'nosti molodezhi: materialy VII Vserossiyskoy nauchno-prakticheskoy zaochnoy konferencii molodyh uchenyh. Lesnikovo, 2015. S. 36-40.
8. Toropova E. Yu., Vorob'eva I. G., Mustafina M. A. [i dr.] Griby roda Fusarium na zerne pshenicy v Zapadnoy Sibiri // Zaschita i karantin rasteniy. 2019. № 1. S. 21-23.
9. Yli-Mattila T., Paavanen-Huhtala S., Parikka P. [et al.] Genetic variation, real-time PCR, metabolites and mycotoxins of Fusarium avenaceum and related species // Mycotoxin Research. 2006. T. 22. Pp. 79-86. DOI:https://doi.org/10.1007/BF02956768.
10. Stakheev A. A., Ryazantsev D. Y., Zavriev S. K. [et al.] PCR detection of Fusarium fungi with similar profiles of the produced mycotoxins // Food Control. 2011. T. 22. No. 3-4. Pp. 462-468. DOI:https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2010.09.028.
11. Orina A. S., Gavrilova O. P., Gagkaeva T. Yu. [i dr.] Cimbioticheskie vzaimootnosheniya gribov Fusarium i Alternaria, koloniziruyuschih zerno ovsa // Sel'skohozyaystvennaya biologiya. 2017. T. 52. № 5. S. 986-994. DOI:https://doi.org/10.15389/agrobiology.2017.5.986rus.
12. Karakotov S. D., Arshava N. V., Bashkatova M. B. Monitoring i kontrol' zabolevaniy pshenicy v Yuzhnom Zaural'e // Zaschita i karantin rasteniy. 2019. № 7. S. 18-25.
13. Gagkaeva T. Yu., Gavrilova O. P., Levitin M. M. [i dr.] Fuzarioz zernovyh kul'tur // Zaschita i karantin rasteniy. 2011. № 5. S. 69-120.
14. Donnik I. M., Bezborodova N. A. Monitoringovye issledovaniya mikotoksinov v kormah i kombikormovom syr'e v Ural'skom regione // Agrarnyy vestnik Urala. 2009. № 8. S. 87-89.
15. Gagkaeva T. Yu., Gavrilova O. P., Orina A. S. Pervoe obnaruzhenie griba Fusarium globosum v mikobiote zernovyh kul'tur na territorii Urala i Sibiri // Vestnik zaschity rasteniy. 2019. № 1. S. 10-18. DOI:https://doi.org/10.31993/2308-6459-2019-1(99)-10-18.
16. Pettersson H. Toxicity and risks with T-2 and HT-2 toxins in cereals // Plant Breeding and Seed Science. 2011. T. 64. Pp. 65-74. DOI:https://doi.org/10.2478/v10129-011-0029-7.
17. Gagkaeva T. Yu., Gavrilova O. P., Levitin M. M. Bioraznoobrazie i arealy osnovnyh toksinoproduciruyuschih gribov roda Fusarium // Biosfera. 2014. T. 6. № 1. S. 36-45.
18. Yli-Mattila T., Gavrilova O., Hussien T. [et al.] Identification of the first Fusarium sibiricum isolate in Iran and Fusarium langsethiae isolate in Siberia by morphology and species-specific primers // Journal of Plant Pathology. 2015. T. 97. No. 1. Pp. 183-187. DOI:https://doi.org/10.4454/JPP.V97I1.017.
19. Edwards S. G., Imathiu S. M., Ray R. V. [et al.] Molecular studies to identify the Fusarium species responsible for HT-2 and T-2 mycotoxins in UK oats // International Journal of Food Microbiology. 2012. T. 156. No. 2. Pp. 168-175. DOI:https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2012.03.020.
20. Schöneberg T., Jenny E., Wettstein F. E. [et al.] Occurrence of Fusarium species and mycotoxins in Swiss oats - impact of cropping factors // European Journal of Agronomy. 2018. T. 92. Pp. 123-132. DOI:https://doi.org/10.1016/j.eja.2017.09.004.
21. Pasquali M., Giraud F., Brochot C. [et al.] Genetic Fusarium chemotyping as a useful tool for predicting nivalenol contamination in winter wheat // International Journal of Food Microbiology. 2010. T. 137. No. 2-3. Pp. 246-253. DOI:https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2009.11.009.
22. Yang S., De Boevre M., Zhang H. [et al.] Unraveling the in vitro and in vivo metabolism of diacetoxyscirpenol in various animal species and human using ultrahigh-performance liquid chromatography-quadrupole/time-of-flight hybrid mass spectrometry // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2015. T. 407. Pp. 8571-8583. DOI:https://doi.org/10.1007/s00216-015-9016-4.
23. Vogelgsang S., Sulyok M., Bänziger I. [et al.] Effect of fungal strain and cereal substrate on in vitro mycotoxin production by Fusarium poae and Fusarium avenaceum // Food Additives & Contaminants: Part A. 2008. T. 25 (6). Pp. 745-757. DOI:https://doi.org/10.1080/02652030701768461.
24. Shipilova N. P., Gavrilova O. P., Gagkaeva T. Yu. Vliyanie zarazhennosti gribami roda Fusarium na kachestvennye harakteristiki zerna ozimoy pshenicy // Vestnik zaschity rasteniy. 2014. № 4. S. 27-31.
25. Beccari G., Caproni L., Tini F. [et al.] Presence of Fusarium species and other toxigenic fungi in malting barley and multi-mycotoxin analysis by liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2016. T. 64. No. 21. Pp. 4390-4399. DOI:https://doi.org/10.1021/acs.jafc.6b00702.
26. Gagkaeva T. Yu., Gavrilova O. P. Fuzarioznaya infekciya i kontaminaciya mikotoksinami zerna sortov yarovogo yachmenya // Vestnik zaschity rasteniy. 2017. № 3. S. 39-43.
27. Yli-Mattila T., Hussien T., Gavrilova O. [et al.] Morphological and molecular variation between Fusarium avenaceum, Fusarium arthrosporioides and Fusarium anguioides strains // Pathogens. 2018. T. 7. No. 4. P. 94. DOI:https://doi.org/10.3390/pathogens7040094.
28. Fraeyman S., Croubels S., Devreese M. [et al.] Emerging Fusarium and Alternaria mycotoxins: occurrence, toxicity and toxicokinetics // Toxins. 2017. T. 9. No. 7. 228. DOI:https://doi.org/10.3390/toxins9070228.
29. Gogina N. N., Kruglova L. M., Kozharinova Yu. S. Mikotoksin moniliformin v kormah: laboratornye metody obnaruzheniya, obzor poluchennyh rezul'tatov // Pticevodstvo. 2019. № 6. S. 65-68. DOI:https://doi.org/10.33845/0033-3239-2019-68-6-65-68.
30. Knutsen H. K., Alexander J. [et al.] Risks to human and animal health related to the presence of moniliformin in food and feed // EFSA Journal. 2018. T. 16. No. 3. e05082. DOI:https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5082.
31. Covarelli L., Beccari G., Prodi A. [et al.] Biosynthesis of beauvericin and enniatins in vitro by wheat Fusarium species and natural grain contamination in an area of central Italy // Food Microbiology. 2015. T. 46. Pp. 618-626. DOI:https://doi.org/10.1016/j.fm.2014.09.009.
