Аннотация. В настоящее время молекулярно-генетические методы с использованием ДНК-маркеров все шире используются в исследованиях полиморфизма различных популяций древесно-кустарниковых растений. Целью данной работы явились оценка и подбор протоколов выделения и очистки ДНК из листьев гледичии трехколючковой (Gleditsia triacanthos L.) для дальнейших исследований с применением ДНК-маркирования. Методы. Для выделения ДНК из листовой пластинки гледичии трехколючковой использовали четыре протокола. В трех протоколах выделения для лизиса клеток использовали анионный детергент додецилсульфат натрия, для очистки от полисахаридов и белков ацетат калия. В четвертом протоколе для лизиса клеток использовали катионный сурфактант цетилтриметил бромид аммония, очистку экстракта проводили смесью хлороформа и изоамилового спирта (24 : 1). Осаждение выделенной ДНК проводили изопропанолом, оценку качества – методом спектрофотомерии, горизонтального электрофореза и ПЦР Real-time с двумя типами праймеров. Результаты. Подобраны оптимальные условия экстракции ДНК из образцов гледичии трехколючковой, содержащей большое количество метаболитов, влияющих на качество выделенного экстракта. Методом электрофореза установлено, что и протокол выделения с додецилсульфатом натрия, и протокол выделения с цетилтриметил бромидом аммония позволяют получить достаточное количество ДНК. Наиболее очищенная ДНК была получена по третьему протоколу с использованием додецилсульфата натрия и дитиотреитола и по четвертому протоколу с использованием цетилтриметиламмония бромида. Результаты ПЦР полученных образцов с праймерами ITS и psbI-psbK свидетельствуют о получении достаточного количества продукта и воспроизводимости ISSR-маркеров. Научная новизна работы состоит в выборе оптимального метода экстракции ДНК из листьев гледичии трехколючковой, являющейся сложным объектом, содержащим большое количество потенциальных ингибиторов ПЦР. Протокол с додецилсульфатом натрия и дитиотреитолом позволил получить ДНК в нужном количестве и приемлемого качества.
экстракция ДНК, цетилтриметиламмония бромид, додецилсульфат натрия, гледичия трехколючковая, молекулярные маркеры
1. Кулаков Е. А., Воробьева Е. А., Сиволапов В. А., Карпеченко Н. А. Оценка полиморфизма дуба черешчатого (Quercus robur) с помощью SSR-анализа // Лесной вестник. 2021. Т. 25. № 4. С. 44-51. DOI:https://doi.org/10.18698/2542-1468-2021-4-44-51.
2. Тараканов В. В., Паленова М. М., Паркина О. В. Роговцев Р. В., Третьякова Р. А. Лесная селекция в России: достижения, проблемы, приоритеты (обзор) // Лесохозяйственная информация. 2021. № 1. С. 100-143. DOI:https://doi.org/10.24419/LHI.2304-3083.2021.1.09.
3. Камнев А. М., Антонова О. Ю., Дунаева С. Е., Гавриленко Т. А., Чухина И. Г. Молекулярные маркеры в исследованиях генетического разнообразия представителей рода Rubus L. и перспективы их применения в селекции // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2020. Т. 24. № 1. С. 20-30. DOI:https://doi.org/10.18699/VJ20.591.
4. Younis A., Ramzan F., Ramzan Y. et al. Molecular Markers Improve Abiotic Stress Tolerance in Crops: A Review // Plants. 2020. No. 9 (10). DOI:https://doi.org/10.3390/plants9101374.
5. Li A., Ma M., Li H., He S., Wang S. Genetic Diversity and Population Differentiation of a Chinese Endangered Plant Ammopiptanthus nanus (M. Pop.) Cheng f. // Genes. Vol. 14. No. 5. Article number 1020. DOI:https://doi.org/10.3390/genes14051020.
6. Корниенко В. О., Калаев В. Н. Эколого-морфологические и биомеханические особенности Gleditsia triacanthos L. в условиях антропогенного загрязнения города Донецка // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2018. № 2. С. 143-151.
7. Адамова Р. М., Казиев М.-Р. А. Эколого-биологические аспекты формирования защитных лесных насаждений в аридных районах // Аридные экосистемы. 2021. № 2 (87). C. 26-32. DOI:https://doi.org/10.24411/1993-3916-2021-10147.
8. Li J., Ye C. Genome-wide analysis of microsatellite and sex-linked marker identification in Gleditsia sinensis // BMC Plant Biology. 2020. Vol. 20 (1).Article number 338. DOI:https://doi.org/10.1186/s12870-020-02551-9.
9. Сальникова Н. А., Самотруева М. А., Коновалов Д. А. Химический состав и фармакологические свойства растений рода Gleditsia L. (обзор литературы) // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». 2019. № 3. С. 87-96. DOI:https://doi.org/10.21626/vestnik/2019-3/12.
10. Inglis P. W., Pappas M. R., Resende L. V., Grattapaglia D. Fast and inexpensive protocols for consistent extraction of high quality DNA and RNA from challenging plant and fungal samples for highthroughput SNP genotyping and sequencing applications Plant Genetics Laboratory // PLOS ONE. 2018. Vol. 13. No. 10. Article number e0206085. DOI:https://doi.org/10.1371/journal.pone.0206085.
11. Islam M. S., Aryasomayajula A., Selvaganapathy P. R. A review on macroscale and microscale cell lysis methods // Micromachines. 2017. Vol. 8. Iss. 3. Article number 83. DOI:https://doi.org/10.3390/mi8030083.
12. Попова А. А., Гродецкая Т. А., Молчанов В. В, Евлаков Р. М. Подбор и оптимизация методов экстракции ДНК из различного растительного материала // Вестник ПГТУ. Серия: Лес. Экология. Природопользование. 2022. № 1 (53). С. 69-76. DOI:https://doi.org/10.25686/2306-2827.2022.1.69.
13. Ильницкая Е. Т., Макаркина М. В., Токмаков С. В., Наумова Л. Г. ДНК-маркерная идентификация локуса устойчивости к милдью Rpv10 в генотипах винограда // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2023. № 2 (27). C. 129-134. DOI:https://doi.org/10.18699/VJGB-23-18.
14. Barbier F. F., Chabikwa T. G., Ahsan M. U. et al. A phenol/chloroform-free method to extract nucleic acids from recalcitrant, woody tropical species for gene expression and sequencing // Plant Methods. 2019. No. 15. Pp. 62-74. DOI:https://doi.org/10.1186/s13007-019-0447-3.
15. Ahmadi E., Kowsari M., Azadfar D., Jouzani G.S. Rapid and economical protocols for genomic and metagenomic DNA extraction from oak (Quercus brantii Lindl.) // Annals of Forest Science. 2018. Vol. 75. Article number 43. DOI: 10.1007 /s13595-018-0705-y.
16. Петров Д. Г., Макарова Е. Д., Гермаш Н. Н., Антифеев И. Е. Методы выделения и очистки ДНК из лизатов клеток (обзор) // Научное приборостроение. 2019. Т. 29. № 4. С. 28-50.
17. Гучетль С. З., Золотавина М. Л., Григорьян А. А., Головатская А. В. Исследование качества ДНК для полимеразной цепной реакции, экстрагированной разными способами из подсолнечника // Масличные культуры. 2021. Вып. 1 (185). С. 32-42. DOI:https://doi.org/10.25230/2412-608Х-2021-1-185-32-42.
18. Pencakowski B. M., Tokarski M., Jonkisz A., Czosnykowska-Łukacka M., Lenard E., Małodobra-Mazur M., Pencakowski B. M. et al. DNA profiling of oaks (Quercus spp.) // Archiwum Medycyny Sądowej i Kryminologii. 2018. Vol. 68. No. 1. DOI:https://doi.org/10.5114/amsik.2018.75942.
19. Zhang Y., Song M., Li H., Sun H., Zhang Z. DNA barcoding identification of original plants of a rare medicinal material Resina Draconis and related Dracaena species // Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2021. Vol. 46, No. 9. Pp. 2173-2181. DOI:https://doi.org/10.19540/j.cnki.cjcmm.20210124.104.
