Abstract. This article summarizes the results of a study of the cultural properties of the swine reproductive and respiratory syndrome virus isolate in transferable cultures of MA-104, PK-15, MARC-145 and Vero cells. The purpose of our research was to determine the sensitivity of cell culture lines to the swine reproductive and respiratory syndrome virus isolate, which is necessary for obtaining a highly active antigen as the main component of diagnostic and vaccine biologics. An isolate of the virus was isolated from a Piglet in the LPH of the Moscow region of the Kolomenskoye district. The isolated isolate of an infectious disease of pigs by the method of molecular biological analysis is characterized in the established order for this pathogen. Novelty. The possibility of reproduction in MARC-145 cell culture has been demonstrated. Results. It was shown that during reproduction of the virus isolate in cell culture for 96 ± 6 hours at a dose of 0.1 TCD50 / cell infection, an antigen with high biological activity was obtained. Infectious activity of the virus on the MARC-145 culture averaged 5.51 ± 0.45 lg TCD50/cm3 after the first three passages (after adaptation). Real-time PCR confirmed the presence of the virus genome in the test samples. Detection of the virus antigen in an infected cell culture was determined by the manifestation of a specific glow in the indirect immunofluorescence (RNIF) reaction in the cell culture monolayer fixed with acetone. It was found that FITZ-conjugate of rabbit polyclonal antibodies to pig immunoglobulins detected antigen-containing cells due to intense illumination.
pig reproductive and respiratory syndrome, cell culture, virus reproduction.
Постановка проблемы (Introduction)
Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС, «голубой аборт», «синее ухо») – высококонтагиозное заболевание, которое наносит значительный экономический урон свиноводству многих стран. Заболевание характеризуется респираторными нарушениями, цианозом кожи ушей и других органов, поздними абортами и мертворождением. Впервые заболевание наблюдалось в США и Канаде в 1986 году, затем оно быстро распространилось в Европу с развитым свиноводством. В 1991 году на первичной культуре клеток свиней был выделен возбудитель вируса [3]. Возбудителем РРСС является РНК-содержащий вирус размером 45–65 нм, имеющий наружную оболочку и чувствительный к липидным растворителям. Возбудитель РРСС относится к семейству Arteriviridae, роду Arterivirus, для него характерна антигенная вариабельность. Каждый год в разных странах мира выделяют новые изоляты вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Изоляты делят на 2 типа по антигенным и генетическим различиям: европейский (Lelystad) и американский (VR-2332). Несмотря на это, до сих пор существуют трудности при выделении вируса и его адаптации в течение длительного культивирования к первичным и перевиваемым культурам клеток. Вирус РРСС успешно репродуцируется в легочных альвеолярных макрофагах (АМФ) поросят. МА-104 и MARC-145 (клоновый вариант, полученный из перевиваемой культуры клеток почки африканской зеленой мартышки) являются чувствительными к репродуктивно-респираторному синдрому свиней.
Методология и методы исследования (Methods)
Целью наших исследований было определение чувствительности к изоляту вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней линий культур клеток, что необходимо для получения высокоактивного антигена как главного компонента диагностических и вакцинных биопрепаратов.
Изолят вируса был выделен в ФГБНУ ВНИТИБП от больного поросенка из ЛПХ Московской области Коломенского района на первичной культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней (АМС) и подтвержден результатами ПЦР. Изолят вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней методом ПЦР был охарактеризован как европейский – генотип 1. Культуральные свойства изолята изучали на перевиваемых линиях культур клеток МА-104, MARC-145 (клон культуры МА-104, полученный из почки мартышки), РК-15 и Vero. Культуры клеток заражали по 0,001–1,0 ТЦД50/кл. вируссодержащим материалом и инкубировали при температуре (37,0 ± 0,5) °С в течение 3–9 суток, оценивая состояние монослоя. Для репродукции вируса и культивирования клеток применяли среду ДМЕМ с содержанием 5–10-процентной фетальной сыворотки крупного рогатого скота. ДМЕМ получали в готовом для использования виде из ООО «БиолоТ» (Санкт-Петербург) и из ООО «ПанЭко» (Москва). Сухой компонент ДМЕМ для приготовления питательной среды по инструкции производителя заказывали в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ВБ) «Вектор» Роспотребнадзора (Новосибирск). Методом ПЦР в реальном времени подтверждали присутствие генома вируса в исследуемых пробах. Обнаружение антигена вируса в зараженной культуре клеток определяли по проявлению специфического свечения в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) в монослое культуры клеток, фиксированной ацетоном. Результаты исследований учитывали с помощью цифровой цветной камеры CMOS 5 Мпикс, адаптера 0,35 С-mount для микроскопа Olympus с подключением компьютера с портом USB 3.0. Биологическую активность полученных материалов определяли путем титрования, титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча в модификации Ашмарина и выражали в lg ТЦД50/см3 [1]. Изолят вируса в культурах клеток культивировали в течение трех последовательных пассажей с последующим определением биологической активности полученных вируссодержащих материалов в культуре клеток.
Результаты (Results)
Проведенные комплексные исследования, включающие вирусологические, молекулярно-генетические методы, подтвердили принадлежность выделенного изолята к репродуктивно респираторному синдрому свиней европейского типа. Выделенный изолят обладал типичными для данного вируса культуральными свойствами и имел высокую степень идентичности к генетической линии репродуктивно-респираторного синдрома свиней, относящегося к европейскому генотипу. В результате проведённых исследований получены следующие данные, которые в сокращенном виде приведены в таблице 1 и представлены на рисунке.
Таблица 1
Результаты исследования активности вируссодержащего материала
|
Наименование |
Номер пассажа вируса |
Период репродукции вируса, часы |
ПЦР: Ct ≤ 40 – положительный результат, Ct ˃ 40 – отрицательный результат |
Инфекционная активность вируса, ТЦД50/см3 |
|
РК-15 |
1 2 3 |
4 |
Ct = 23,68 Ct = 23,88 Ct = 23,94 |
5,05 ± 0,21 5,01 ± 0,13 4,97 ± 0,12 |
|
МА-104 |
1 2 3 |
4 |
Ct = 22,58 Ct = 19,92 Ct = 13,29 |
5,25 ± 0,22 5,33 ± 0,25 5,22 ± 0,24 |
|
MARC-145 |
1 2 3 |
4 |
Ct = 16,75 Ct = 23,10 Ct = 18,09 |
5,69 ± 0,21 5,13 ± 0,19 5,22 ± 0,15 |
|
Vero |
1 2 3 |
4 |
Ct = 14,86 Ct = 20,17 Ct = 17,03 |
4,61 ± 0,15 4,57 ± 0,17 4,39 ± 0,14 |
Table 1
The results of the study of the biological activity of virus-containing material
|
Name |
Virus passage number |
Virus reproduction period, hours |
PCR: Ct ≤ 40 – positive, Ct ˃ 40 – negative
|
Infectious activity of the virus,
TСD50/cm3
|
|
РК-15 |
1 2 3 |
4 |
Ct = 23.68 Ct = 23.88 Ct = 23.94 |
5.05 ± 0.21 5.01 ± 0.13 4.97 ± 0.12 |
|
МА-104 |
1 2 3 |
4 |
Ct = 22.58 Ct = 19.92 Ct = 13.29 |
5.25 ± 0.22 5.33 ± 0.25 5.22 ± 0.24 |
|
Мarc-145 |
1 2 3 |
4 |
Ct = 16.75 Ct = 23.10 Ct = 18.09 |
5.69 ± 0.21 5.13 ± 0.19 5.22 ± 0.15 |
|
Vero |
1 2 3 |
4 |
Ct = 14.86 Ct = 20.17 Ct = 17.03 |
4.61 ± 0.15 4.57 ± 0.17 4.39 ± 0.14 |
Рис. Культура клеток MARC-145 неинфицированная (контрольная) и инфицированная вирусом РРСС. Увеличение 1×20, камера с монитором HDM
Fig. Cell culture MARC-145 uninfected (control) and infected with swine reproductive and respiratory syndrome virus. Magnification 1×20, the camera monitor with HDM
Инфекционная активность вируса составляла в среднем 5,5 ± 0,5 lg ТЦД50/см3. В процессе пассирования отмечали постепенное накопление вируса. Данные свидетельствуют о том, что титр вируса в культуре клеток MARC-145 находился на достаточно высоком уровне, увеличился к пятому пассажу на 0,47 ± 0,01 логарифма и составил 5,12 ± 0,04 lg ТЦД50/см3. Также провели опыты по определению множественности заражения и времени культивирования вируса. Использовали дозы заражения 0,01; 0,1 и 1,0 ТЦД50/кл. Результаты показали, что при использовании дозы заражения 0,1 ТЦД50/кл отмечали наиболее высокое накопление вируса. С увеличением срока культивирования его инфекционная активность повышалась и достигала максимума к 96 часам, титр вируса составил 5,04 ± 0,14 lg ТЦД50/см3 при множественности заражения 0,1 ТЦД50/кл, в то время как при множественности заражения 0,01 ТЦД50/кл титр вируса к 96 часам составил 4,57 ± 0,16 lg ТЦД50/см3, а при 1,0 ТЦД50/кл – 4,68 ± 0,14 lg ТЦД50/см3. Инфекционная активность вируса на культуре MARC-145 составляла в среднем после трех первых пассажей (после адаптации) 5,51 ± 0,45 lg ТЦД50/см3.
С целью предоставления изоляту вируса наилучших условий для репродукции все культуры клеток, участвующие в настоящем исследовании, адаптировали к питательным средам, сывороткам, глютамину, промывочным и диспергирующим растворам и т. п. В процессе исследования чувствительности изолята вируса к перевиваемым линиям клеток было установлено, что питательные среды разных производителей оказывали значительное влияние на количество посевной концентрации клеток и качество полученного монослоя. Суспензию клеток МА-104, РК-15, MARC-145 и Vero с концентрацией от 70 до 400 тыс. в см3 вносили в разные культуральные сосуды. Качество монослоя оценивали через каждые 2 часа после посева в течение рабочего дня. При испытании влияния ростовых питательных сред ДМЕМ разных изготовителей на скорость и качество формирования монослоя клеток MARC-145 в данные среды добавляли 7–10 % сыворотки крови крупного рогатого скота, 0,5–0,7 мг/см3 глютамина. Результаты исследований по оценке оптимальной посевной концентрации клеток на примере культуры MARC-145 при использовании питательных сред разных производителей представлены в таблицах 2–4.
Таблица 2
Скорость формирования и качество монослоя в зависимости от посевной концентрации клеток MARC-145 при использовании ДМЕМ ООО «БиолоТ», n = 4
|
Концентрация клеток, тыс. в см3 |
Формирование монослоя, часы |
Визуальная оценка качества монослоя |
|
70 ± 10 |
100 ± 2 |
Неудовлетворительно |
|
100 ± 10 |
91 ± 1 |
Неудовлетворительно |
|
150 ± 10 |
72 ± 0,5 |
Удовлетворительно |
|
200 ± 10 |
37 ± 0,3 |
Хорошо |
|
250 ± 10 |
27 ± 0,8 |
Плотный монослой |
|
300 ± 10 |
25 ± 0,7 |
Плотный монослой с небольшим вытеснением клеток и ростом на поверхности |
|
350 ± 10 |
22 ± 0,9 |
Плотный монослой с вытеснением клеток и ростом на поверхности |
|
400 ± 10 |
20 ± 0,4 |
Плотный монослой с вытеснением клеток и ростом на поверхности |
Table 2
The rate of formation and quality of the monolayer depending on the inoculum concentration of MARC-145 cells when using DMEM “BioloT”, n = 4
|
The concentration of cells, thousand in cm3 |
Monolayer formation, hours |
Visual assessment of monolayer quality |
|
70 ± 10 |
100 ± 2 |
Unsatisfactorily |
|
100 ± 10 |
91 ± 1 |
Unsatisfactorily |
|
150 ± 10 |
72 ± 0.5 |
Satisfactorily |
|
200 ± 10 |
37 ± 0.3 |
Good |
|
250 ± 10 |
27 ± 0.8 |
Dense monolayer |
|
300 ± 10 |
25 ± 0.7 |
Dense monolayer |
|
350 ± 10 |
22 ± 0.9 |
Dense monolayer with the displacement of cells up and their growth on the surface of the monolayer |
|
400 ± 10 |
20 ± 0.4 |
Dense monolayer with the displacement of cells up and their growth on the surface of the monolayer |
Таблица 3
Скорость формирования и качество монослоя в зависимости от посевной концентрации клеток MARC-145 при использовании ДМЕМ ООО «ПанЭко», n = 4
|
Концентрация клеток, тыс. в см3 |
Формирование монослоя, часы |
Визуальная оценка качества монослоя |
|
70 ± 10 |
100 ± 4,0 |
Неудовлетворительно |
|
100 ± 10 |
91 ± 2,0 |
Неудовлетворительно |
|
150 ± 10 |
82 ± 3,0 |
Удовлетворительно |
|
200 ± 10 |
37 ± 3,1 |
Удовлетворительно |
|
250 ± 10 |
29 ± 2,12 |
Хорошо |
|
300 ± 10 |
25 ± 0,6 |
Хорошо |
|
350 ± 10 |
28 ± 1,1 |
Плотный монослой |
|
400 ± 10 |
26 ± 1,3 |
Плотный монослой с вытеснением клеток и ростом на поверхности |
Table 3
The rate of formation and quality of the monolayer depending on the seeding concentration of MARC-145 cells when using DMEM “PanEco”, n = 4
|
The concentration of cells, thousand in cm3 |
Monolayer formation, hours |
Visual assessment of monolayer quality |
|
70 ± 10 |
100 ± 4.0 |
Unsatisfactorily |
|
100 ± 10 |
91 ± 2.0 |
Unsatisfactorily |
|
150 ± 10 |
82 ± 3.0 |
Satisfactorily |
|
200 ± 10 |
37 ± 3.1 |
Satisfactorily |
|
250 ± 10 |
29 ± 2.12 |
Good |
|
300 ± 10 |
25 ± 0.6 |
Good |
|
350 ± 10 |
28 ± 1.1 |
Dense monolayer |
|
400 ± 10 |
26 ± 1.3 |
Dense monolayer |
Удовлетворительный культуры клеток MARC-145 на ДМЕМ ООО «БиолоТ» получали через 72 ± 0,5 часа при посевной концентрации 150 ± 10 тыс. кл/см3. При посеве более низкой посевной концентрации клеток монослой формировался значительно позднее. Применение при посевной концентрации более 250 тыс. клеток в см3 приводило к формированию плотного монослоя с вытеснением клеток и их росту на поверхности монослоя. Удовлетворительный монослой культуры клеток MARC-145 на ДМЕМ ООО «ПанЭко» получали через 37 ± 3,1 часа при посевной концентрации не менее 200 ± 10 тыс. кл/см3. При использовании питательной среды ДМЕМ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» удовлетворительный результат формирования монослоя получали через 79 ± 2,0 часа после начала культивирования при посевной концентрации 100 тыс. клеток в см3.
При использовании питательной среды ДМЕМ производства ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» при репродукции вируса сформировавшийся монослой всех типов культур клеток, используемых в экспериментах, был всегда плотный и ровный. Питательные cреды ДМЕМ других производителей могли приводить к образованию изолированных зон роста клеток, которые не всегда смыкались в сплошной монослой даже через 72 часа после высева клеток в культуральные сосуды. Поэтому во всех дальнейших исследованиях по изучению изолятов вируса, в том числе и с целью получения диагностических и вакцинных препаратов было принято решение использовать только питательные среды, поставленные из ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Таблица 4
Скорость формирования и качество монослоя в зависимости от посевной концентрации клеток MARC-145 при использовании ДМЕМ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», n = 14
|
Концентрация клеток, тыс. в см3 |
Формирование монослоя, часы |
Визуальная оценка качества монослоя |
|
70 ± 10 |
95 ± 7,1 |
Неудовлетворительно |
|
100 ± 10 |
79 ± 2,0 |
Удовлетворительно |
|
150 ± 10 |
66 ± 2,3 |
Хорошо |
|
200 ± 10 |
34 ± 1,0 |
Хорошо |
|
250 ± 10 |
29 ± 3,1 |
Плотный монослой |
|
300 ± 10 |
26 ± 2,0 |
Плотный монослой с небольшим вытеснением клеток и ростом на поверхности |
|
350 ± 10 |
20 ± 0,51 |
Плотный монослой с вытеснением клеток и ростом на поверхности |
|
400 ± 10 |
18 ± 1,2 |
Плотный монослой с вытеснением клеток и ростом на поверхности |
Table 4
The rate of formation and quality of the monolayer depending on the seeding concentration of MARC-145 cells when using DMEM State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector”, n = 14
|
The concentration of cells, thousand in cm3 |
Monolayer formation, hours |
Visual assessment of monolayer quality |
|
70 ± 10 |
95 ± 7.1 |
Unsatisfactorily |
|
100 ± 10 |
79 ± 2.0 |
Satisfactorily |
|
150 ± 10 |
66 ± 2.3 |
Good |
|
200 ± 10 |
34 ± 1.0 |
Good |
|
250 ± 10 |
29 ± 3.1 |
Dense monolayer |
|
300 ± 10 |
26 ± 2.0 |
Dense monolayer with slight cell elongation and surface growth |
|
350 ± 10 |
20 ± 0.51 |
Dense monolayer with the displacement of cells up and their growth on the surface of the monolayer |
|
400 ± 10 |
18 ± 1.2 |
Dense monolayer with the displacement of cells up and their growth on the surface of the monolayer |
Обсуждение и выводы (Discussion and Conclusion)
Так как изолят вируса оказался генетически стабильным, то он может быть рекомендован для изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Этот изолят оказался продуктивным в культурах клеток МА-104 и Marc-145, прошел 15 пассажей, что имеет преимущество для репродукции вируса и получения антигена с целью дальнейшего изучения его молекулярно-генетических свойств.
1. Bogomolova O. A., Matveeva I. N., Popova V. M. Chuvstvitel'nost' perevivaemyh liniy kul'tur kletok MARC-145 i MA-104 k izolyatu virusa cirkovirusnoy infekcii sviney // Nauchnyy al'manah. 2018. № 5.2 (43). S. 166-169. DOI:https://doi.org/10.17117/na.2018.05.02.166.
2. Glotov A. G., Koteneva S. V., Glotova T. I., Yuzhakov A. G., Maksyutov R. A., Zaberezhnyy A. D. Filogeneticheskiy analiz pestivirusov krupnogo rogatogo skota, vyyavlennyh v Sibiri // Voprosy virusologii. 2018. T. 63. № 4. S. 185-191
3. Gulyukin A. M., Shabeykin A. A., Makarov V. V., Zaykova O. N., Grebennikova T. V., Zaberezhnyy A. D., Polyakova I. V., Yuzhakov A. G. Osobennosti epizootologicheskogo processa i molekulyarno-geneticheskaya harakteristika izolyatov virusa beshenstva, vyyavlennyh na territorii Tverskoy oblasti // Voprosy virusologii. 2018. T. 63. № 3. S. 115-122.
4. Esimbekova N. B., Tulemisova Zh. K. Chuvstvitel'nost' perevivaemyh liniy kul'tur kletok k izolyatu virusa cirkovirusnoy infekcii sviney // Nauchnyy vzglyad molodyh: poiski, innovacii v APK: sbornik materialov mezhdunarodnoy nauchno-prakticheskoy konferencii molodyh uchenyh. Almaty, 2017. T. 2. S. 41-42.
5. Zaberezhnyy A. D., Kostina L. V., Yuzhakov A. G., Gulyukina I. A., Stepanova T. V., Stafford V. V., Polyakova I. V., Drozdova E. I. Sovremennaya taksonomiya virusov // Veterinariya i kormlenie. 2017. № 1. S. 4-13.
6. Zaberezhnyy A. D., Iskandarov M. I., Gulyukin A. M., Fedorov A. I., Iskandarova S. S., Vinokurov N. T. Katalogizaciya genotipov shtammov iz kollekcii patogennyh i vakcinnyh shtammov mikroorganizmov - vozbuditeley infekcionnyh bolezney zhivotnyh // Ippologiya i veterinariya. 2019. № 3 (33). S. 105-111.
7. Popova V. M., Matveeva I. N., Ivanov I. V., Markova E. V., Preobrazhenskaya A. S., Bogomolova O. A. Izuchenie reprodukcii cirkovirusa sviney 2 tipa v perevivaemoy kul'ture kletok MARC-145 // Trudy VIEV. 2018. T. 80. Ch. II. S. 68-72. DOI:https://doi.org/10.30917//ATT-PRINT-2018-4.
8. Stafford V. V., Zaberezhnyy A. D., Gulyukin M. I. Patomorfologicheskie izmeneniya parenhimatoznyh organov porosyat, eksperimental'no zarazhennyh virusom reproduktivno-respiratornogo sindroma sviney i cirkovirusom sviney tipa 2 // Veterinariya. 2016. № 9. S. 24-27.
9. Stafford V. V., Raev S. A., Alekseev K. P., Yuzhakov A. G., Aliper T. I., Zaberezhnyy A. D., Gulyukin M. I., Verhovskiy O. A. Immunogistohimicheskiy metod vyyavleniya virusa reproduktivno-respiratornogo sindroma sviney // Veterinariya. 2017. № 2. S. 26-30.
10. Stafford V. V., Strel'cova Ya. B., Raev S. A., Yuzhakov A. G., Zaberezhnyy A. D., Aliper T. I., Ispol'zovanie metoda immunogistohimii pri diagnostike cirkovirusnyh bolezney sviney // Veterinariya. 2019. № 8. S. 18-22.
11. Stafford V. V., Korickaya M. A., Raev S. A., Alekseev K. P., Cibezov V. V., Verhovskiy O. A., Aliper T. I., Zaberezhnyy A. D., Gulyukin M. I. Nauchno-obosnovannaya sistema protivoepizooticheskih meropriyatiy i sovremennye sposoby diagnostiki, specificheskoy profilaktiki i lecheniya infekcionnyh bolezney sel'skohozyaystvennyh zhivotnyh. Novosibirsk, 2019. DOI:https://doi.org/10.13140/RG.2.2.22203.77607/1.
12. Yuzhakov A. G., Raev S. A., Nepoklonov E. A., Zaberezhnyy A. D., Alekseev K. P. Aktual'nye infekcionnye bolezni sviney / Pod red. T. I. Alipera. M. : Izdatel'stvo «Zoovetkniga», 2019. 395 s.
13. Bai W., Wang Z., Sun P., Zhang J., Bao H., Cao Y., Chang Y., Liu Z., Li D., Lu Z. The molecular characteristic analysis of PRRSV GSWW/2015 strain and its pathogenicity to pigs // BMC Vet. Res. 2018. No. 14 (1). P. 240.
14. Feehan B. J., Penin A. A., Mukhin A. N., Kumar D., Moskvina A. S., Khametova K. M., Yuzhakov A. G., Musienko M. I., Zaberezhny A. D., Aliper T. I., Marthaler D., Alekseev K. P., Novel Mammalian orthorubalovirus 5 discovered as accidental cell culture contaminant // Viruses. 2019. T. 11. No. 9. P. 777.
15. Raev S. A., Yuzhakov A. G., Alekseev K. P., Kostina L. V., Gulyukin M. I., Stepanova T. V., Zaberezhniy A. D., Aliper T. I. Transmission of Porcine Circovirus type 2 (PCV2) in Russia and Genotype association (PCV2D) with Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome (PDNS) // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. 2019. P. 042026.
16. Yuzhakov A. G., Raev S. A., Alekseev K. P., Grebennikova T. V., Verkhovsky O. A., Zaberezhny A. D., Aliper T. I. First detection and full genome sequence of porcine circovirus type 3 in Russia // Virus Genes. 2018. No. 54 (4). Pp. 608-611.
17. Yuzhakov A. G., Raev S. A., Skrylev A. N., Mishin A. M., Grebennikova T. V., Verkhovsky O. A., Zaberezhny A. D., Trus I., Nauwynck H. J., Aliper T. I. Genetic and pathogenic characterization of a Russian subtype 2 PRRSV-1 isolate // Vet. Microbiol. 2017. No. 211. Pp. 22-28.
