Аннотация. В данной статье обобщены результаты исследования культуральных свойств изолята вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней в перевиваемых культурах клеток МА-104, РК-15, MARC-145 и Vero. Целью исследований было определение чувствительности к изоляту вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней линий культур клеток, что необходимо для получения высокоактивного антигена как главного компонента диагностических и вакцинных биопрепаратов. Изолят вируса был выделен от поросенка в ЛПХ Московской области Коломенского района. Выделенный изолят инфекционного заболевания свиней методом молекулярно-биологического анализа охарактеризован в установленном для данного возбудителя порядке. Новизна. Продемонстрирована возможность репродукции вируса в культуре клеток MARC-145. Результаты. Показано, что при репродукции изолята вируса в культуре клеток в течение 96 ± 6 часов при дозе заражения 0,1 ТЦД50/кл получали антиген с высокой биологической активностью. Инфекционная активность вируса на культуре MARC-145 составляла в среднем после трех первых пассажей (после адаптации) 5,51 ± 0,45 lg ТЦД50/см3. Методом ПЦР в реальном времени подтверждено присутствие генома вируса в исследуемых пробах. Обнаружение антигена в инфицированной вирусом культуре клеток определяли по проявлению специфического свечения в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) в монослое культуры клеток, фиксированной ацетоном. Установлено, что ФИТЦ-конъюгат кроличьих поликлональных антител к иммуноглобулинам свиньи выявлял антигенсодержащие клетки зеленоватым интенсивным свечением.
репродуктивно-респираторный синдром свиней, культура клеток, репродукция вируса.
Постановка проблемы (Introduction)
Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС, «голубой аборт», «синее ухо») – высококонтагиозное заболевание, которое наносит значительный экономический урон свиноводству многих стран. Заболевание характеризуется респираторными нарушениями, цианозом кожи ушей и других органов, поздними абортами и мертворождением. Впервые заболевание наблюдалось в США и Канаде в 1986 году, затем оно быстро распространилось в Европу с развитым свиноводством. В 1991 году на первичной культуре клеток свиней был выделен возбудитель вируса [3]. Возбудителем РРСС является РНК-содержащий вирус размером 45–65 нм, имеющий наружную оболочку и чувствительный к липидным растворителям. Возбудитель РРСС относится к семейству Arteriviridae, роду Arterivirus, для него характерна антигенная вариабельность. Каждый год в разных странах мира выделяют новые изоляты вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Изоляты делят на 2 типа по антигенным и генетическим различиям: европейский (Lelystad) и американский (VR-2332). Несмотря на это, до сих пор существуют трудности при выделении вируса и его адаптации в течение длительного культивирования к первичным и перевиваемым культурам клеток. Вирус РРСС успешно репродуцируется в легочных альвеолярных макрофагах (АМФ) поросят. МА-104 и MARC-145 (клоновый вариант, полученный из перевиваемой культуры клеток почки африканской зеленой мартышки) являются чувствительными к репродуктивно-респираторному синдрому свиней.
Методология и методы исследования (Methods)
Целью наших исследований было определение чувствительности к изоляту вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней линий культур клеток, что необходимо для получения высокоактивного антигена как главного компонента диагностических и вакцинных биопрепаратов.
Изолят вируса был выделен в ФГБНУ ВНИТИБП от больного поросенка из ЛПХ Московской области Коломенского района на первичной культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней (АМС) и подтвержден результатами ПЦР. Изолят вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней методом ПЦР был охарактеризован как европейский – генотип 1. Культуральные свойства изолята изучали на перевиваемых линиях культур клеток МА-104, MARC-145 (клон культуры МА-104, полученный из почки мартышки), РК-15 и Vero. Культуры клеток заражали по 0,001–1,0 ТЦД50/кл. вируссодержащим материалом и инкубировали при температуре (37,0 ± 0,5) °С в течение 3–9 суток, оценивая состояние монослоя. Для репродукции вируса и культивирования клеток применяли среду ДМЕМ с содержанием 5–10-процентной фетальной сыворотки крупного рогатого скота. ДМЕМ получали в готовом для использования виде из ООО «БиолоТ» (Санкт-Петербург) и из ООО «ПанЭко» (Москва). Сухой компонент ДМЕМ для приготовления питательной среды по инструкции производителя заказывали в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ВБ) «Вектор» Роспотребнадзора (Новосибирск). Методом ПЦР в реальном времени подтверждали присутствие генома вируса в исследуемых пробах. Обнаружение антигена вируса в зараженной культуре клеток определяли по проявлению специфического свечения в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) в монослое культуры клеток, фиксированной ацетоном. Результаты исследований учитывали с помощью цифровой цветной камеры CMOS 5 Мпикс, адаптера 0,35 С-mount для микроскопа Olympus с подключением компьютера с портом USB 3.0. Биологическую активность полученных материалов определяли путем титрования, титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча в модификации Ашмарина и выражали в lg ТЦД50/см3 [1]. Изолят вируса в культурах клеток культивировали в течение трех последовательных пассажей с последующим определением биологической активности полученных вируссодержащих материалов в культуре клеток.
Результаты (Results)
Проведенные комплексные исследования, включающие вирусологические, молекулярно-генетические методы, подтвердили принадлежность выделенного изолята к репродуктивно респираторному синдрому свиней европейского типа. Выделенный изолят обладал типичными для данного вируса культуральными свойствами и имел высокую степень идентичности к генетической линии репродуктивно-респираторного синдрома свиней, относящегося к европейскому генотипу. В результате проведённых исследований получены следующие данные, которые в сокращенном виде приведены в таблице 1 и представлены на рисунке.
Таблица 1
Результаты исследования активности вируссодержащего материала
|
Наименование |
Номер пассажа вируса |
Период репродукции вируса, часы |
ПЦР: Ct ≤ 40 – положительный результат, Ct ˃ 40 – отрицательный результат |
Инфекционная активность вируса, ТЦД50/см3 |
|
РК-15 |
1 2 3 |
4 |
Ct = 23,68 Ct = 23,88 Ct = 23,94 |
5,05 ± 0,21 5,01 ± 0,13 4,97 ± 0,12 |
|
МА-104 |
1 2 3 |
4 |
Ct = 22,58 Ct = 19,92 Ct = 13,29 |
5,25 ± 0,22 5,33 ± 0,25 5,22 ± 0,24 |
|
MARC-145 |
1 2 3 |
4 |
Ct = 16,75 Ct = 23,10 Ct = 18,09 |
5,69 ± 0,21 5,13 ± 0,19 5,22 ± 0,15 |
|
Vero |
1 2 3 |
4 |
Ct = 14,86 Ct = 20,17 Ct = 17,03 |
4,61 ± 0,15 4,57 ± 0,17 4,39 ± 0,14 |
Table 1
The results of the study of the biological activity of virus-containing material
|
Name |
Virus passage number |
Virus reproduction period, hours |
PCR: Ct ≤ 40 – positive, Ct ˃ 40 – negative
|
Infectious activity of the virus,
TСD50/cm3
|
|
РК-15 |
1 2 3 |
4 |
Ct = 23.68 Ct = 23.88 Ct = 23.94 |
5.05 ± 0.21 5.01 ± 0.13 4.97 ± 0.12 |
|
МА-104 |
1 2 3 |
4 |
Ct = 22.58 Ct = 19.92 Ct = 13.29 |
5.25 ± 0.22 5.33 ± 0.25 5.22 ± 0.24 |
|
Мarc-145 |
1 2 3 |
4 |
Ct = 16.75 Ct = 23.10 Ct = 18.09 |
5.69 ± 0.21 5.13 ± 0.19 5.22 ± 0.15 |
|
Vero |
1 2 3 |
4 |
Ct = 14.86 Ct = 20.17 Ct = 17.03 |
4.61 ± 0.15 4.57 ± 0.17 4.39 ± 0.14 |
Рис. Культура клеток MARC-145 неинфицированная (контрольная) и инфицированная вирусом РРСС. Увеличение 1×20, камера с монитором HDM
Fig. Cell culture MARC-145 uninfected (control) and infected with swine reproductive and respiratory syndrome virus. Magnification 1×20, the camera monitor with HDM
Инфекционная активность вируса составляла в среднем 5,5 ± 0,5 lg ТЦД50/см3. В процессе пассирования отмечали постепенное накопление вируса. Данные свидетельствуют о том, что титр вируса в культуре клеток MARC-145 находился на достаточно высоком уровне, увеличился к пятому пассажу на 0,47 ± 0,01 логарифма и составил 5,12 ± 0,04 lg ТЦД50/см3. Также провели опыты по определению множественности заражения и времени культивирования вируса. Использовали дозы заражения 0,01; 0,1 и 1,0 ТЦД50/кл. Результаты показали, что при использовании дозы заражения 0,1 ТЦД50/кл отмечали наиболее высокое накопление вируса. С увеличением срока культивирования его инфекционная активность повышалась и достигала максимума к 96 часам, титр вируса составил 5,04 ± 0,14 lg ТЦД50/см3 при множественности заражения 0,1 ТЦД50/кл, в то время как при множественности заражения 0,01 ТЦД50/кл титр вируса к 96 часам составил 4,57 ± 0,16 lg ТЦД50/см3, а при 1,0 ТЦД50/кл – 4,68 ± 0,14 lg ТЦД50/см3. Инфекционная активность вируса на культуре MARC-145 составляла в среднем после трех первых пассажей (после адаптации) 5,51 ± 0,45 lg ТЦД50/см3.
С целью предоставления изоляту вируса наилучших условий для репродукции все культуры клеток, участвующие в настоящем исследовании, адаптировали к питательным средам, сывороткам, глютамину, промывочным и диспергирующим растворам и т. п. В процессе исследования чувствительности изолята вируса к перевиваемым линиям клеток было установлено, что питательные среды разных производителей оказывали значительное влияние на количество посевной концентрации клеток и качество полученного монослоя. Суспензию клеток МА-104, РК-15, MARC-145 и Vero с концентрацией от 70 до 400 тыс. в см3 вносили в разные культуральные сосуды. Качество монослоя оценивали через каждые 2 часа после посева в течение рабочего дня. При испытании влияния ростовых питательных сред ДМЕМ разных изготовителей на скорость и качество формирования монослоя клеток MARC-145 в данные среды добавляли 7–10 % сыворотки крови крупного рогатого скота, 0,5–0,7 мг/см3 глютамина. Результаты исследований по оценке оптимальной посевной концентрации клеток на примере культуры MARC-145 при использовании питательных сред разных производителей представлены в таблицах 2–4.
Таблица 2
Скорость формирования и качество монослоя в зависимости от посевной концентрации клеток MARC-145 при использовании ДМЕМ ООО «БиолоТ», n = 4
|
Концентрация клеток, тыс. в см3 |
Формирование монослоя, часы |
Визуальная оценка качества монослоя |
|
70 ± 10 |
100 ± 2 |
Неудовлетворительно |
|
100 ± 10 |
91 ± 1 |
Неудовлетворительно |
|
150 ± 10 |
72 ± 0,5 |
Удовлетворительно |
|
200 ± 10 |
37 ± 0,3 |
Хорошо |
|
250 ± 10 |
27 ± 0,8 |
Плотный монослой |
|
300 ± 10 |
25 ± 0,7 |
Плотный монослой с небольшим вытеснением клеток и ростом на поверхности |
|
350 ± 10 |
22 ± 0,9 |
Плотный монослой с вытеснением клеток и ростом на поверхности |
|
400 ± 10 |
20 ± 0,4 |
Плотный монослой с вытеснением клеток и ростом на поверхности |
Table 2
The rate of formation and quality of the monolayer depending on the inoculum concentration of MARC-145 cells when using DMEM “BioloT”, n = 4
|
The concentration of cells, thousand in cm3 |
Monolayer formation, hours |
Visual assessment of monolayer quality |
|
70 ± 10 |
100 ± 2 |
Unsatisfactorily |
|
100 ± 10 |
91 ± 1 |
Unsatisfactorily |
|
150 ± 10 |
72 ± 0.5 |
Satisfactorily |
|
200 ± 10 |
37 ± 0.3 |
Good |
|
250 ± 10 |
27 ± 0.8 |
Dense monolayer |
|
300 ± 10 |
25 ± 0.7 |
Dense monolayer |
|
350 ± 10 |
22 ± 0.9 |
Dense monolayer with the displacement of cells up and their growth on the surface of the monolayer |
|
400 ± 10 |
20 ± 0.4 |
Dense monolayer with the displacement of cells up and their growth on the surface of the monolayer |
Таблица 3
Скорость формирования и качество монослоя в зависимости от посевной концентрации клеток MARC-145 при использовании ДМЕМ ООО «ПанЭко», n = 4
|
Концентрация клеток, тыс. в см3 |
Формирование монослоя, часы |
Визуальная оценка качества монослоя |
|
70 ± 10 |
100 ± 4,0 |
Неудовлетворительно |
|
100 ± 10 |
91 ± 2,0 |
Неудовлетворительно |
|
150 ± 10 |
82 ± 3,0 |
Удовлетворительно |
|
200 ± 10 |
37 ± 3,1 |
Удовлетворительно |
|
250 ± 10 |
29 ± 2,12 |
Хорошо |
|
300 ± 10 |
25 ± 0,6 |
Хорошо |
|
350 ± 10 |
28 ± 1,1 |
Плотный монослой |
|
400 ± 10 |
26 ± 1,3 |
Плотный монослой с вытеснением клеток и ростом на поверхности |
Table 3
The rate of formation and quality of the monolayer depending on the seeding concentration of MARC-145 cells when using DMEM “PanEco”, n = 4
|
The concentration of cells, thousand in cm3 |
Monolayer formation, hours |
Visual assessment of monolayer quality |
|
70 ± 10 |
100 ± 4.0 |
Unsatisfactorily |
|
100 ± 10 |
91 ± 2.0 |
Unsatisfactorily |
|
150 ± 10 |
82 ± 3.0 |
Satisfactorily |
|
200 ± 10 |
37 ± 3.1 |
Satisfactorily |
|
250 ± 10 |
29 ± 2.12 |
Good |
|
300 ± 10 |
25 ± 0.6 |
Good |
|
350 ± 10 |
28 ± 1.1 |
Dense monolayer |
|
400 ± 10 |
26 ± 1.3 |
Dense monolayer |
Удовлетворительный культуры клеток MARC-145 на ДМЕМ ООО «БиолоТ» получали через 72 ± 0,5 часа при посевной концентрации 150 ± 10 тыс. кл/см3. При посеве более низкой посевной концентрации клеток монослой формировался значительно позднее. Применение при посевной концентрации более 250 тыс. клеток в см3 приводило к формированию плотного монослоя с вытеснением клеток и их росту на поверхности монослоя. Удовлетворительный монослой культуры клеток MARC-145 на ДМЕМ ООО «ПанЭко» получали через 37 ± 3,1 часа при посевной концентрации не менее 200 ± 10 тыс. кл/см3. При использовании питательной среды ДМЕМ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» удовлетворительный результат формирования монослоя получали через 79 ± 2,0 часа после начала культивирования при посевной концентрации 100 тыс. клеток в см3.
При использовании питательной среды ДМЕМ производства ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» при репродукции вируса сформировавшийся монослой всех типов культур клеток, используемых в экспериментах, был всегда плотный и ровный. Питательные cреды ДМЕМ других производителей могли приводить к образованию изолированных зон роста клеток, которые не всегда смыкались в сплошной монослой даже через 72 часа после высева клеток в культуральные сосуды. Поэтому во всех дальнейших исследованиях по изучению изолятов вируса, в том числе и с целью получения диагностических и вакцинных препаратов было принято решение использовать только питательные среды, поставленные из ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Таблица 4
Скорость формирования и качество монослоя в зависимости от посевной концентрации клеток MARC-145 при использовании ДМЕМ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», n = 14
|
Концентрация клеток, тыс. в см3 |
Формирование монослоя, часы |
Визуальная оценка качества монослоя |
|
70 ± 10 |
95 ± 7,1 |
Неудовлетворительно |
|
100 ± 10 |
79 ± 2,0 |
Удовлетворительно |
|
150 ± 10 |
66 ± 2,3 |
Хорошо |
|
200 ± 10 |
34 ± 1,0 |
Хорошо |
|
250 ± 10 |
29 ± 3,1 |
Плотный монослой |
|
300 ± 10 |
26 ± 2,0 |
Плотный монослой с небольшим вытеснением клеток и ростом на поверхности |
|
350 ± 10 |
20 ± 0,51 |
Плотный монослой с вытеснением клеток и ростом на поверхности |
|
400 ± 10 |
18 ± 1,2 |
Плотный монослой с вытеснением клеток и ростом на поверхности |
Table 4
The rate of formation and quality of the monolayer depending on the seeding concentration of MARC-145 cells when using DMEM State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector”, n = 14
|
The concentration of cells, thousand in cm3 |
Monolayer formation, hours |
Visual assessment of monolayer quality |
|
70 ± 10 |
95 ± 7.1 |
Unsatisfactorily |
|
100 ± 10 |
79 ± 2.0 |
Satisfactorily |
|
150 ± 10 |
66 ± 2.3 |
Good |
|
200 ± 10 |
34 ± 1.0 |
Good |
|
250 ± 10 |
29 ± 3.1 |
Dense monolayer |
|
300 ± 10 |
26 ± 2.0 |
Dense monolayer with slight cell elongation and surface growth |
|
350 ± 10 |
20 ± 0.51 |
Dense monolayer with the displacement of cells up and their growth on the surface of the monolayer |
|
400 ± 10 |
18 ± 1.2 |
Dense monolayer with the displacement of cells up and their growth on the surface of the monolayer |
Обсуждение и выводы (Discussion and Conclusion)
Так как изолят вируса оказался генетически стабильным, то он может быть рекомендован для изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Этот изолят оказался продуктивным в культурах клеток МА-104 и Marc-145, прошел 15 пассажей, что имеет преимущество для репродукции вируса и получения антигена с целью дальнейшего изучения его молекулярно-генетических свойств.
1. Богомолова О. А., Матвеева И. Н., Попова В. М. Чувствительность перевиваемых линий культур клеток MARC-145 и MA-104 к изоляту вируса цирковирусной инфекции свиней // Научный альманах. 2018. № 5.2 (43). С. 166-169. DOI:https://doi.org/10.17117/na.2018.05.02.166.
2. Глотов А. Г., Котенева С. В., Глотова Т. И., Южаков А. Г., Максютов Р. А., Забережный А. Д. Филогенетический анализ пестивирусов крупного рогатого скота, выявленных в Сибири // Вопросы вирусологии. 2018. Т. 63. № 4. С. 185-191
3. Гулюкин А. М., Шабейкин А. А., Макаров В. В., Зайкова О. Н., Гребенникова Т. В., Забережный А. Д., Полякова И. В., Южаков А. Г. Особенности эпизоотологического процесса и молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса бешенства, выявленных на территории Тверской области // Вопросы вирусологии. 2018. Т. 63. № 3. С. 115-122.
4. Есимбекова Н. Б., Тулемисова Ж. К. Чувствительность перевиваемых линий культур клеток к изоляту вируса цирковирусной инфекции свиней // Научный взгляд молодых: поиски, инновации в АПК: сборник материалов международной научно-практической конференции молодых ученых. Алматы, 2017. Т. 2. С. 41-42.
5. Забережный А. Д., Костина Л. В., Южаков А. Г., Гулюкина И. А., Степанова Т. В., Стаффорд В. В., Полякова И. В., Дроздова Е. И. Современная таксономия вирусов // Ветеринария и кормление. 2017. № 1. С. 4-13.
6. Забережный А. Д., Искандаров М. И., Гулюкин А. М., Федоров А. И., Искандарова С. С., Винокуров Н. Т. Каталогизация генотипов штаммов из коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов - возбудителей инфекционных болезней животных // Иппология и ветеринария. 2019. № 3 (33). С. 105-111.
7. Попова В. М., Матвеева И. Н., Иванов И. В., Маркова Е. В., Преображенская А. С., Богомолова О. А. Изучение репродукции цирковируса свиней 2 типа в перевиваемой культуре клеток MARC-145 // Труды ВИЭВ. 2018. Т. 80. Ч. II. С. 68-72. DOI:https://doi.org/10.30917//ATT-PRINT-2018-4.
8. Стаффорд В. В., Забережный А. Д., Гулюкин М. И. Патоморфологические изменения паренхиматозных органов поросят, экспериментально зараженных вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней и цирковирусом свиней типа 2 // Ветеринария. 2016. № 9. С. 24-27.
9. Стаффорд В. В., Раев С. А., Алексеев К. П., Южаков А. Г., Алипер Т. И., Забережный А. Д., Гулюкин М. И., Верховский О. А. Иммуногистохимический метод выявления вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней // Ветеринария. 2017. № 2. С. 26-30.
10. Стаффорд В. В., Стрельцова Я. Б., Раев С. А., Южаков А. Г., Забережный А. Д., Алипер Т. И., Использование метода иммуногистохимии при диагностике цирковирусных болезней свиней // Ветеринария. 2019. № 8. С. 18-22.
11. Стаффорд В. В., Корицкая М. А., Раев С. А., Алексеев К. П., Цибезов В. В., Верховский О. А., Алипер Т. И., Забережный А. Д., Гулюкин М. И. Научно-обоснованная система противоэпизоотических мероприятий и современные способы диагностики, специфической профилактики и лечения инфекционных болезней сельскохозяйственных животных. Новосибирск, 2019. DOI:https://doi.org/10.13140/RG.2.2.22203.77607/1.
12. Южаков А. Г., Раев С. А., Непоклонов Е. А., Забережный А. Д., Алексеев К. П. Актуальные инфекционные болезни свиней / Под ред. Т. И. Алипера. М. : Издательство «Зооветкнига», 2019. 395 с.
13. Bai W., Wang Z., Sun P., Zhang J., Bao H., Cao Y., Chang Y., Liu Z., Li D., Lu Z. The molecular characteristic analysis of PRRSV GSWW/2015 strain and its pathogenicity to pigs // BMC Vet. Res. 2018. No. 14 (1). P. 240.
14. Feehan B. J., Penin A. A., Mukhin A. N., Kumar D., Moskvina A. S., Khametova K. M., Yuzhakov A. G., Musienko M. I., Zaberezhny A. D., Aliper T. I., Marthaler D., Alekseev K. P., Novel Mammalian orthorubalovirus 5 discovered as accidental cell culture contaminant // Viruses. 2019. Т. 11. No. 9. P. 777.
15. Raev S. A., Yuzhakov A. G., Alekseev K. P., Kostina L. V., Gulyukin M. I., Stepanova T. V., Zaberezhniy A. D., Aliper T. I. Transmission of Porcine Circovirus type 2 (PCV2) in Russia and Genotype association (PCV2D) with Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome (PDNS) // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. 2019. P. 042026.
16. Yuzhakov A. G., Raev S. A., Alekseev K. P., Grebennikova T. V., Verkhovsky O. A., Zaberezhny A. D., Aliper T. I. First detection and full genome sequence of porcine circovirus type 3 in Russia // Virus Genes. 2018. No. 54 (4). Pp. 608-611.
17. Yuzhakov A. G., Raev S. A., Skrylev A. N., Mishin A. M., Grebennikova T. V., Verkhovsky O. A., Zaberezhny A. D., Trus I., Nauwynck H. J., Aliper T. I. Genetic and pathogenic characterization of a Russian subtype 2 PRRSV-1 isolate // Vet. Microbiol. 2017. No. 211. Pp. 22-28.
