Russian Federation
Abstract. Intraovarian vitrification of oocytes of farm animals today is a very promising direction. The composition of cryoprotective solutions requires further improvement. Vitrification of ovarian fragments (FО) allows tо save primordial follicles, a structure that is more stable, due to the lack of follicular fluid, to destructive processes provoked by ultra-low temperatures.The high reproductive potential of pigs is due to their physiological characteristics of growth and development. Silicon is a minor trace element in its content; it is increasingly used in pharmacology, veterinary medicine, and clinical practice. Nitrogen silicon dimethylglycerolate (SDMGC) are antimicrobial, wound healing and anti-inflammatory in nature. The presence of a compact cumulus surrounding the oocyte is one of the important indicators of the reliability of the female gamete for extrafollicular maturation. Purpose of this study: to was to evaluate the effect of introducing 0.2 % silicon dimethylglycerolate into cryoprotective solutions during intraovarian vitrification and the medium for maturation of devitrified oocyte-cumulus complexes of pigs on the morphology of cumulus cells and the state of nuclear material. Ovarian fragments of pigs (15mmx 20mm) to vitrification are exposed prior for 25 minutes and 15 minutes direct in cryoprotective solutions of the following composition: CPA 1 – 7.5 % ethylene glycol (EG), 7.5 % dimethyl sulfoxide (DMSO), 65 % phosphate-buffered saline (PBS), 20 % fetal bovine serum (PBS); CPA 2 – 20 % EG, 20 % DMSO, 60 % FSB, 0.5 mol / L sucrose. The experimental group was treated for 10 minutes in a solution of phosphate-saline buffer with 0.2 % SDMGC. Hoechst 33258 was used to evaluate chromatin status, samples were analyzed using a ZEISS Axio Imager Imager A 2 m microscope.The result. Incubation of ovarian fragments of pigs in a solution containing 0.2 % SDMGC before vitrification, as well as the introduction of 0.2 % SDMGC in the composition of oocyte maturation media, had a positive effect on the morphology of cumulus cells (degree of expansion) after the thawing procedure. The proportion of compact cumulus devitrified cells pretreated with 0.2 % SDMGC increased compared with the control group (64 % vs 56 %, P < 0.05 (χ2-test). The level of oocytes with cumulus is in a high degree of expansion after 44 hours of cultivation with 0.2 % SDMGC in the experimental group was 75 % vs 54 % in the control group, P < 0.05 (χ2-test). The use of SDMGC in the cultivation of devitrified oocyte-cumulus complexes of pigs for 44 hours increased the proportion of matured oocytes from 41 % in the control group to 64 % in the experimental group P < 0.05 (χ2-test). The scientific novelty: the stages of the technology of intraovarian vitrification of porcine oocytes by means of preventive incubation of ovarian fragments in a solution of 0.2 % SDMGC and its introduction into the medium for culturing oocyte-cumulus complexes were modernized.
vitrification, oocyte-cumulus complex, ovarian fragments, cumulus cells, silicon dimethylglycerolate (SDMGC), Sus Scrofa Domesticus.
Постановка проблемы (Introduction)
Использующиеся в настоящее время способы замораживания (медленное замораживание, витрификация) и хранения живых биологических объектов в криобанках, обеспечивают сохранность генетического материала сельскохозяйственных животных в течение длительного времени с возможностью восстановления их биологических функций после оттаивания [1, с. 564], [2, с. 861]. В криохранилищах с помощью методов глубокого замораживания в жидком азоте коллекционируется ценный биоматериал, обеспечивая безопасное хранение с минимальным риском потерь в будущем [3, с. 283]. Криоконсервация создает возможность проведения научных исследований в области фундаментальных основ репродуктивной технологии, способствует генетическому мониторингу редких популяций животных, обеспечивая систематизацию информационных данных [4, с. 56–57]. По сравнению с традиционными методами криоконсервации витрификация более эффективна, проста, менее затратна по времени, не использует сложных дорогостоящих устройств. Процесс витрификации обеспечивает переход жидкости в твердое состояние без кристаллизации с увеличением вязкости в момент охлаждения. В сравнении с медленным замораживанием преимуществом витрификации является практически неограниченный срок хранения половых клеток без снижения их жизнеспособности [5, с. 160]. Однако, несмотря на многочисленные разработки криобиологов, эффективных протоколов криоконсервации ооцитов большинства видов сельскохозяйственных животных до сих пор не существует [6, с. 613]. Успех витрификации во многом обусловлен подбором оптимальных составов криопротекторных растворов. Высокие концентрации криопротекторов в растворах имеют токсичный эффект, что приводит к повреждению ооцита. Комбинации криопротекторов в одном буферном солевом растворе (высококонцентрированных проникающих криопротекторов и непроникающих криопротекторов) вызывают эффект синергизма и защищают замораживаемые объекты от повреждений с минимальной токсичностью, чем эти компоненты по отдельности [7, с. 577], [8, с. 2–3.]. Биологически активные материалы, имеющие в своем составе кремний, в последние годы все чаще используются в фармакологии и клинической практике [9, с. 74], [10, с. 22]. Одним из таких представителей является диметилглицеролат кремния (CH3)2Si(С3Н7О3)2·C3H8O3, синтезированный в Институте органического синтеза им. И. Я. Постовского УрО РАН. Диметилглицеролаты кремния (ДМГК) характеризуются антимикробным, ранозаживляющим и противовоспалительным действиями [11, с. 92]. Криоконсервация фрагментов яичников становится достойной альтернативой криоконсервации ооцитов [12, с. 67], [13, с. 1240]. Данный метод позволяет сохранять примордиальные фолликулы, которые более устойчивы к дегенерации, спровоцированной воздействием сверхнизких температур, чем антральные фолликулы [14, с. 613].Цель настоящего исследования – оценить проспективные потенции ДМГК как криопротекторного агента в технологии интраовариальной витрификации ооцит-кумулюсных комплексов свиней.
Методология и методы исследования (Methods)
В лабораторию для эксперимента доставляли яичники свиней породы ландрас с убойного пункта. Объектом исследования служили ооцит-кумулюсные комплексы, полученные путем резекции овариальных фолликулов девитрифицированных фрагментов. Схема витрификации и выбор временных параметров обработки ФЯ свиней (экспозиция в растворах криопротекторных агентов (КПА) 25 мин. и 15 мин. последовательно), а также концентрация диметилглицеролата кремния и время выдержки в растворе определялась протоколами, разработанными нами ранее [15, с. 66, 68]. Опытная группа ФЯ свиней (15×20 мм) инкубировалась в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), содержащем 0,2 % ДМГК, в течение 10 мин. Для заморозки ФЯ последовательно погружали в растворы, содержащие КПА (1 – 7,5 % этиленгликоль (ЭГ), 7,5 % диметилсульфоксид (ДМСО), 65 % фосфатно-солевой буфер (ФСБ), 20 % фетальная бычья сыворотка (ФБС); 2 – 20 % ЭГ, 20 % ДМСО, 60 % ФСБ, 0,5 моль/л сахарозы) в течение 25 и 15 мин. Заморозка контрольных и опытных групп ФЯ в жидком азоте происходила 24 часа. Витрифицированные образцы обеих групп оттаивали поочередно сначала в течение 1 мин. в растворе, состоящем из 80 % ФСБ, 20 % ФБС, 0,5 моль/л сахарозы, а затем 5 мин. в растворе из 80 % ФСБ, 0,25 моль/л сахарозы. После оттаивания производился отбор ооцит-кумулюсных комплексов для культивирования в соответствии с общепринятыми морфологическими критериям. Отобранные ооцит-кумулюсные комплексы свиней контрольной группы культивировали при температуре 38,5 °C, в атмосфере, содержащей 5 % СО2, в течение 44 часов в среде Sage Media Cleavage (SMC, Сoopersurgical, США) с 5 % Serum Protein Substitut (SPS, Сoopersurgical, США) и 10 М.Е. хорионического гонадотропина человека (Россия, Московский эндокринный завод). Опытные группы ооцитов культивировались в контрольной среде с добавлением 0,2 % ДМГК. Оценку степени экспансии кумулюса девитрифицированных ооцит-кумулюсных комплексов проводили на микроскопе МБС-9 при увеличении 2×14. Для анализа ядерного материала ооцит-кумулюсные комплексы очищались от клеток кумулюса и окрашивались в растворе фосфатного буфера и глицерина с добавлением 25 мг флуоресцентного красителя Hoechst 33258. Цитологическая оценка хроматина ооцитов проводилась с помощью микроскопа Carl Zeiss AxioImager А 2 m. В экспериментах использовали реагенты производства фирмы Sigma-Aldrich, за исключением указанных. Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали при трех уровнях значимости (P < 0,05; P < 0,01; P < 0,001), используя критерий χ2 (статистическая программа Sigma Stat).
Результаты (Results)
После процедуры интраовариальной витрификации отмечено значительное число денудированных ооцитов (без кумулюса) в обеих исследуемых группах, считающихся непригодными для последующего созревания (54 % в контрольной группе против 48 % в опытной группе). Ооцит-кумулюсные взаимодействия – важный фактор приобретения ооцитами компетентности к формированию яйцеклетки и дальнейшему оплодотворению. Если до культивирования маркером высокого качества ооцита является наличие нескольких слоев (5–6) компактного кумулюса, окружающего ооцит, то процесс созревания ооцита сопровождается активной пролиферацией кумулюсных клеток с их дальнейшей дифференцировкой и активной продукцией биологически активных веществ, необходимых для завершения мейотического созревания ооцита [16, с. 1, 4]. В наших исследованиях показано, что введение в состав криопротекторных сред 0,2 % ДМГК оказало положительное влияние на сохранность клеток кумулюса после девитрификации. Доля клеток с компактным кумулюсом после процедуры оттаивания при этом возрастает до 64 % по сравнению с контролем 56 % (P < 0,05), а уровень ооцитов с высокоэкспандированным кумулюсом значительно снижен (10 % в опытной группе против 21 % в контроле (P < 0,05)) (рис. 1).
Рис. 1. Оценка морфологии кумулюса ооцитов свиней после интраовариальной витрификации (n ооцитов – 239; 3 повторности). Достоверность различий χ2-test: a:b; c:d P < 0,05, e:f P < 0,001
Fig. 1. Assessment of the cumulus morphology of porcine oocytes after intraovarian vitrification (n of oocytes – 239; 3 replicates). Significance of differences χ2-test: a:b ;c:d P < 0.05, e:f P < 0.001
Известно, что одним из признаков созревания женской гаметы является активная экспансия клеток кумулюса. В наших исследованиях введение в состав среды для культивирования ДМГК обеспечило значительный рост доли девитрифицированных ооцитов с высокоэкспандированным кумулюсом по завершении культивирования (75 % в опытной против 54 % в контрольной группе (P < 0,05)), (рис. 2).
Рис. 2. Оценка морфологии кумулюса девитрифицированных ооцитов свиней после 44 часов культивирования (n ооцитов – 227; 3 повторности). Достоверность различий χ2-test: a:b P < 0,001,c:d; e:f P < 0,05
Fig. 2. Assessment of the cumulus morphology of devitrified porcine oocytes after 44 hours of cultivation (n of oocytes – 227; 3 replicates). Significance of differences χ2-test: a:b P< 0.001, c:d; e:fP < 0.05
Проведенная нами оценка статуса хроматина ооцитов после 44 культивирования показала, что обработка ФЯ свиней 0,2 % ДМГК перед замораживанием, а также введение его в состав культуральных сред снижали уровень дегенерированных клеток (14 % в опытной против 20 % в контрольной группе (P < 0,05)), а также способствовали достижению ооцитами стадии метафаза II (64 % в опытной против 41 % в контрольной группе (P < 0,05)), (рис. 3).
Рис. 3. Статус хроматина девитрифицированных ооцитов свиней после 44 часов культивирования (n ооцитов – 213; 3 повторности). Достоверность различий χ2-test: a:b; c:d P < 0,05
Fig. 3. Chromatin status of devitrified porcine oocytes after 44 hours of cultivation (n of oocytes – 213; 3 replicates). Significance of differences χ2-test: a:b ;c:d P < 0.05
Обсуждение и выводы (Discussion and Conclusion)
Инкубирование фрагментов яичников свиней перед витрификацией в растворах, содержащих ДМГК в концентрации 0,2 %, привело к увеличению доли клеток с компактным кумулюсом после оттаивания. Культивирование девитрифицированных ооцитов свиней в течение 44 часов с диметилглицеролатом кремния обеспечило повышение доли девитрифицированных ооцитов с высокоэкспандированным кумулюсом и улучшению показателей ядерного созревания. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о целесообразности использования ДМГК в концентрации 0,2 % в качестве криопротекторного агента в технологии витрификации женских гамет, а также его введения в состав сред для культивирования ооцитов Sus Scrofa Domesticus.
Благодарности (Acknowledgements)
Работа выполнена в соответствии с темой Министерства образования Российской Федерации, номер госрегистрации – АААА-А18-118021590132-9.
1. Amstislavskiy S. Ya., Mokrousova V. I., Kozhevnikova V. V., Kizilova E. A., Brusencev E. Yu. Kriobank geneticheskih resursov koshach'ih // Vavilovskiy zhurnal genetiki i selekcii. 2017. T. 21. № 5. S. 561-568. DOI:https://doi.org/10.18699/VJ17.27o.
2. Gahova E. N., Uteshev V. K., Shishova N. V., Ivlicheva N. A., Kaurova S. A., Kramarova L. I., Mel'nikova E. V. Rol' geneticheskih kriobankov v sohranenii redkih i ischezayuschih vidov // Vestnik Tambovskogo universiteta. 2017. T. 22. № 5. S. 861-865. DOI: 10. 20310/1810-0198-2017-22-5-861-865.
3. Iolchiev B. S., Abilov A. I., Tadzhieva A. V., Bagirov V. A. Biologicheskaya polnocennost' epididimal'nogo semeni zubra (Bison bonasus L.) pri kriokonservacii i dlitel'nom hranenii // Sel'skohozyaystvennaya biologiya. 2017. T. 52. № 2. S. 282-290. DOI:https://doi.org/10.15389/agrobiology.2017.2.282rus.
4. Aybazov M. M., Mamontova T. V. Sozdanie bioresursnyh kollekciy - neobhodimoe uslovie sohraneniya i racional'nogo ispol'zovaniya geneticheskih resursov zhivotnyh // Sel'skohozyaystvennyy zhurnal. 2018. № 2 (11). S. 54-62. DOI:https://doi.org/10.25930/47pm-n875.
5. Kuz'mina T. I., Sheyko I. P., Gandzha A. I., Stefanova V. N. Vitrifikaciya oocitov kak sposob sohraneniya genofonda zhivotnyh // Genetika i biotehnologiya XXI veka: problemy, dostizheniya, perspektivy: materialy II Mezhdunarodnoy nauchnoy konferencii, posvyaschennoy 50-letiyu osnovaniya Instituta genetiki i citologii NAN Belarusi. Minsk, 2015. S. 160-172.
6. Abakushina E. V., Gel'm Yu. V., Micenyk A. S. Fluorescentnyy mikroskopicheskiy analiz zhiznesposobnosti oocitov mlekopitayuschih posle vitrifikacii // Optika i spektroskopiya. 2019. T. 126. Vyp. 5. S. 611-613. DOI:https://doi.org/10.21883/OS.2019.05.47660.9-19.
7. Somfai T., et al. Optimization of cryoprotectant treatment for the vitrification of immature cumulus-enclosed porcine oocytes: comparison of sugars, combinations of permeating cryoprotectants and equilibration regimens // Journal Reproduction and Development. 2015. Vol. 18. No. 61 (6). Pp. 571-579.
8. Kamoshita M., et al. Successful vitrification of pronuclear-stage pig embryos with a novel cryoprotective agent, carboxylatedε-poly-L-lysine // Public Library of Science (PLoS). 2017. Pp. 1-12. DOI:https://doi.org/10.1371/journal.pone.0176711.
9. Burnatova E. N., Schipacheva O. V., Tuzankina I. A., Honina T. G., Ryabuhin I. V., Grigor'eva Yu. V., Mal'chikov A. I. Sravnitel'nyy effekt kremniycink soderzhaschego glicerogidrogelya i testiruemyh immunotropnyh preparatov na modeli grippoznoy infekcii u myshey // Dal'nevostochnyy zhurnal infekcionnoy patologii. 2016. № 31. C. 73-76.
10. Kuzmina T. I., Stanislavovich T. I., Kravtsov V. Yu. Cytoprotective effect of highly dispersed silica nanoparticles on the viability of granulosa from porcine follicles // Russian Journal of Developmental Biology. 2018. Vol. 49. No. 4S. Pp. 22-23.
11. Sarkisyan N. G., Ron' G. I., Tuzankina I. A., Honina T. G., Larionov L. P., Simbircev A. S., Drozdova L. I., Timchenko A. S. Morfologicheskaya ocenka effektivnosti ispol'zovaniya farmakologicheskih kompoziciy na osnove kremniyorganicheskogo glicerogidrogelya // Immunologiya. 2017. T. 38. № 2. S. 91-96. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-2-91-96.
12. Sanfilippo S., Canis M., Smitz J., et al. Vitrification of human ovarian tissue: a practical and relevant alternative to slow freezing // Reproductive Biology and Endocrinology. 2015. No. 13. Pp. 67. DOIhttps://doi.org/10.1186/s12958-015-0065-5.
13. Mouttham L., et al. Damage to fetal bovine ovarian tissue caused by cryoprotectant exposure and vitrification is mitigatedduring tissue culture // Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 2015. Vol. 32. No. 8. Pp. 1239-1250.
14. Suzuki N., Yoshioka N., Takae S., Sugishita Y., Tamura M., Hashimoto S. et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency // Human Reproduction. 2015. Vol. 30. No. 3.Pp. 608-615. DOIhttps://doi.org/10.1093/humrep/deu353.
15. Stanislavovich T. I., Kuz'mina T. I., Molchanov A. V. Vliyanie intraovarial'noy vitrifikacii na pokazateli kriorezistentnosti oocit-kumulyusnyh kompleksov sviney // Voprosy normativno-pravovogo regulirovaniya v veterinarii. 2019. № 4. S. 65-70. DOI:https://doi.org/10.17238/issn2072-6023.2019.4.
16. Macaulay D. Angus, et al. Cumulus cell transcripts transit to the bovine oocyte in preparation for maturation // Biology of reproduction. 2016. Vol. 94. No. 1 (16). Pp. 1-11.
