Россия
Аннотация. Интраовариальная витрификация ооцитов сельскохозяйственных животных на сегодняшний день является весьма перспективным направлением. Отдельные этапы этого способа, прежде всего, состав криопротекторных растворов, требуют дальнейшего совершенствования. Витрификация фрагментов яичников (ФЯ) позволяет сохранять примордиальные фолликулы, структура которых более устойчива в силу отсутствия фолликулярной жидкости, к деструктивным процессам, провоцируемым воздействием сверхнизких температур. Высокий репродуктивный потенциал свиней обусловлен их физиологическими особенностями. Кремний является вторым по содержанию микроэлементом, а соединения на его основе все чаще применяются в фармакологии, ветеринарии, клинической практике. Диметилглицеролаты кремния (ДМГК) характеризуются антимикробным, ранозаживляющим и противовоспалительным действиями. Наличие компактного кумулюса, окружающего ооцит, является одним из важных показателей компетентности женской гаметы к экстрафолликулярному созреванию. Цель исследования – оценить проспективные потенции ДМГК как криопротекторного агента в технологии интраовариальной витрификации ооцит-кумулюсных комплексов свиней. Методы. Фрагменты яичников свиней (15×20 мм) до витрификации экспонировали в течение 25 мин. и 15 мин. последовательно в растворах криопротекторов следующего состава: 1 – 7,5 % этиленгликоль (ЭГ), 7,5 % диметилсульфоксид (ДМСО), 65 % фосфатно-солевой буфер (ФСБ), 20 % фетальная бычья сыворотка (ФБС); 2 – 20 % ЭГ, 20 % ДМСО, 60 % ФСБ, 0,5 моль/л сахарозы. Опытная группа обрабатывалась в течение 10 мин. в растворе фосфатно-солевого буфера с 0,2 % ДМГК. Для оценки статуса хроматина использовали Hoechst 33258, образцы анализировали на микроскопе ZEISS AxioImager А 2 m. Результаты исследования. Инкубирование фрагментов яичников свиней в растворе, содержащем 0,2 % ДМГК перед витрификацией, а также введение 0,2 % ДМГК в состав сред для созревания ооцитов оказало положительное влияние на морфологию клеток кумулюса (степень экспансии) после процедуры оттаивания. Доля девитрифицированных клеток с компактным кумулюсом, предварительно обработанных 0,2 % ДМГК, увеличилась по сравнению с контрольной группой с 56 % до 64 %, (P < 0,05, критерий χ2). Уровень ооцитов с кумулюсом с высокой степенью экспансии после 44 часов культивирования с 0,2 % ДМГК составил в опытной группе 75 % против 54 % в контрольной группе, (P < 0,05, критерий χ2). Использование ДМГК при культивировании девитрифицированных ооцит-кумулюсных комплексов свиней в течение 44 часов увеличило долю созревших ооцитов с 41 % в контрольной группе до 64 % в опытной группе, (P < 0,05, критерий χ2). Научная новизна. Модернизированы этапы технологии интраовариальной витрификации ооцитов свиней путем превентивной инкубации фрагментов яичников в растворе 0,2 % ДМГК и введением его в среды для культивирования ооцит-кумулюсных комплексов.
витрификация, ооцит-кумулюсный комплекс, фрагменты яичников, кумулюсные клетки, диметилглицеролат кремния (ДМГК), Sus Scrofa Domesticus.
Постановка проблемы (Introduction)
Использующиеся в настоящее время способы замораживания (медленное замораживание, витрификация) и хранения живых биологических объектов в криобанках, обеспечивают сохранность генетического материала сельскохозяйственных животных в течение длительного времени с возможностью восстановления их биологических функций после оттаивания [1, с. 564], [2, с. 861]. В криохранилищах с помощью методов глубокого замораживания в жидком азоте коллекционируется ценный биоматериал, обеспечивая безопасное хранение с минимальным риском потерь в будущем [3, с. 283]. Криоконсервация создает возможность проведения научных исследований в области фундаментальных основ репродуктивной технологии, способствует генетическому мониторингу редких популяций животных, обеспечивая систематизацию информационных данных [4, с. 56–57]. По сравнению с традиционными методами криоконсервации витрификация более эффективна, проста, менее затратна по времени, не использует сложных дорогостоящих устройств. Процесс витрификации обеспечивает переход жидкости в твердое состояние без кристаллизации с увеличением вязкости в момент охлаждения. В сравнении с медленным замораживанием преимуществом витрификации является практически неограниченный срок хранения половых клеток без снижения их жизнеспособности [5, с. 160]. Однако, несмотря на многочисленные разработки криобиологов, эффективных протоколов криоконсервации ооцитов большинства видов сельскохозяйственных животных до сих пор не существует [6, с. 613]. Успех витрификации во многом обусловлен подбором оптимальных составов криопротекторных растворов. Высокие концентрации криопротекторов в растворах имеют токсичный эффект, что приводит к повреждению ооцита. Комбинации криопротекторов в одном буферном солевом растворе (высококонцентрированных проникающих криопротекторов и непроникающих криопротекторов) вызывают эффект синергизма и защищают замораживаемые объекты от повреждений с минимальной токсичностью, чем эти компоненты по отдельности [7, с. 577], [8, с. 2–3.]. Биологически активные материалы, имеющие в своем составе кремний, в последние годы все чаще используются в фармакологии и клинической практике [9, с. 74], [10, с. 22]. Одним из таких представителей является диметилглицеролат кремния (CH3)2Si(С3Н7О3)2·C3H8O3, синтезированный в Институте органического синтеза им. И. Я. Постовского УрО РАН. Диметилглицеролаты кремния (ДМГК) характеризуются антимикробным, ранозаживляющим и противовоспалительным действиями [11, с. 92]. Криоконсервация фрагментов яичников становится достойной альтернативой криоконсервации ооцитов [12, с. 67], [13, с. 1240]. Данный метод позволяет сохранять примордиальные фолликулы, которые более устойчивы к дегенерации, спровоцированной воздействием сверхнизких температур, чем антральные фолликулы [14, с. 613].Цель настоящего исследования – оценить проспективные потенции ДМГК как криопротекторного агента в технологии интраовариальной витрификации ооцит-кумулюсных комплексов свиней.
Методология и методы исследования (Methods)
В лабораторию для эксперимента доставляли яичники свиней породы ландрас с убойного пункта. Объектом исследования служили ооцит-кумулюсные комплексы, полученные путем резекции овариальных фолликулов девитрифицированных фрагментов. Схема витрификации и выбор временных параметров обработки ФЯ свиней (экспозиция в растворах криопротекторных агентов (КПА) 25 мин. и 15 мин. последовательно), а также концентрация диметилглицеролата кремния и время выдержки в растворе определялась протоколами, разработанными нами ранее [15, с. 66, 68]. Опытная группа ФЯ свиней (15×20 мм) инкубировалась в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), содержащем 0,2 % ДМГК, в течение 10 мин. Для заморозки ФЯ последовательно погружали в растворы, содержащие КПА (1 – 7,5 % этиленгликоль (ЭГ), 7,5 % диметилсульфоксид (ДМСО), 65 % фосфатно-солевой буфер (ФСБ), 20 % фетальная бычья сыворотка (ФБС); 2 – 20 % ЭГ, 20 % ДМСО, 60 % ФСБ, 0,5 моль/л сахарозы) в течение 25 и 15 мин. Заморозка контрольных и опытных групп ФЯ в жидком азоте происходила 24 часа. Витрифицированные образцы обеих групп оттаивали поочередно сначала в течение 1 мин. в растворе, состоящем из 80 % ФСБ, 20 % ФБС, 0,5 моль/л сахарозы, а затем 5 мин. в растворе из 80 % ФСБ, 0,25 моль/л сахарозы. После оттаивания производился отбор ооцит-кумулюсных комплексов для культивирования в соответствии с общепринятыми морфологическими критериям. Отобранные ооцит-кумулюсные комплексы свиней контрольной группы культивировали при температуре 38,5 °C, в атмосфере, содержащей 5 % СО2, в течение 44 часов в среде Sage Media Cleavage (SMC, Сoopersurgical, США) с 5 % Serum Protein Substitut (SPS, Сoopersurgical, США) и 10 М.Е. хорионического гонадотропина человека (Россия, Московский эндокринный завод). Опытные группы ооцитов культивировались в контрольной среде с добавлением 0,2 % ДМГК. Оценку степени экспансии кумулюса девитрифицированных ооцит-кумулюсных комплексов проводили на микроскопе МБС-9 при увеличении 2×14. Для анализа ядерного материала ооцит-кумулюсные комплексы очищались от клеток кумулюса и окрашивались в растворе фосфатного буфера и глицерина с добавлением 25 мг флуоресцентного красителя Hoechst 33258. Цитологическая оценка хроматина ооцитов проводилась с помощью микроскопа Carl Zeiss AxioImager А 2 m. В экспериментах использовали реагенты производства фирмы Sigma-Aldrich, за исключением указанных. Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали при трех уровнях значимости (P < 0,05; P < 0,01; P < 0,001), используя критерий χ2 (статистическая программа Sigma Stat).
Результаты (Results)
После процедуры интраовариальной витрификации отмечено значительное число денудированных ооцитов (без кумулюса) в обеих исследуемых группах, считающихся непригодными для последующего созревания (54 % в контрольной группе против 48 % в опытной группе). Ооцит-кумулюсные взаимодействия – важный фактор приобретения ооцитами компетентности к формированию яйцеклетки и дальнейшему оплодотворению. Если до культивирования маркером высокого качества ооцита является наличие нескольких слоев (5–6) компактного кумулюса, окружающего ооцит, то процесс созревания ооцита сопровождается активной пролиферацией кумулюсных клеток с их дальнейшей дифференцировкой и активной продукцией биологически активных веществ, необходимых для завершения мейотического созревания ооцита [16, с. 1, 4]. В наших исследованиях показано, что введение в состав криопротекторных сред 0,2 % ДМГК оказало положительное влияние на сохранность клеток кумулюса после девитрификации. Доля клеток с компактным кумулюсом после процедуры оттаивания при этом возрастает до 64 % по сравнению с контролем 56 % (P < 0,05), а уровень ооцитов с высокоэкспандированным кумулюсом значительно снижен (10 % в опытной группе против 21 % в контроле (P < 0,05)) (рис. 1).
Рис. 1. Оценка морфологии кумулюса ооцитов свиней после интраовариальной витрификации (n ооцитов – 239; 3 повторности). Достоверность различий χ2-test: a:b; c:d P < 0,05, e:f P < 0,001
Fig. 1. Assessment of the cumulus morphology of porcine oocytes after intraovarian vitrification (n of oocytes – 239; 3 replicates). Significance of differences χ2-test: a:b ;c:d P < 0.05, e:f P < 0.001
Известно, что одним из признаков созревания женской гаметы является активная экспансия клеток кумулюса. В наших исследованиях введение в состав среды для культивирования ДМГК обеспечило значительный рост доли девитрифицированных ооцитов с высокоэкспандированным кумулюсом по завершении культивирования (75 % в опытной против 54 % в контрольной группе (P < 0,05)), (рис. 2).
Рис. 2. Оценка морфологии кумулюса девитрифицированных ооцитов свиней после 44 часов культивирования (n ооцитов – 227; 3 повторности). Достоверность различий χ2-test: a:b P < 0,001,c:d; e:f P < 0,05
Fig. 2. Assessment of the cumulus morphology of devitrified porcine oocytes after 44 hours of cultivation (n of oocytes – 227; 3 replicates). Significance of differences χ2-test: a:b P< 0.001, c:d; e:fP < 0.05
Проведенная нами оценка статуса хроматина ооцитов после 44 культивирования показала, что обработка ФЯ свиней 0,2 % ДМГК перед замораживанием, а также введение его в состав культуральных сред снижали уровень дегенерированных клеток (14 % в опытной против 20 % в контрольной группе (P < 0,05)), а также способствовали достижению ооцитами стадии метафаза II (64 % в опытной против 41 % в контрольной группе (P < 0,05)), (рис. 3).
Рис. 3. Статус хроматина девитрифицированных ооцитов свиней после 44 часов культивирования (n ооцитов – 213; 3 повторности). Достоверность различий χ2-test: a:b; c:d P < 0,05
Fig. 3. Chromatin status of devitrified porcine oocytes after 44 hours of cultivation (n of oocytes – 213; 3 replicates). Significance of differences χ2-test: a:b ;c:d P < 0.05
Обсуждение и выводы (Discussion and Conclusion)
Инкубирование фрагментов яичников свиней перед витрификацией в растворах, содержащих ДМГК в концентрации 0,2 %, привело к увеличению доли клеток с компактным кумулюсом после оттаивания. Культивирование девитрифицированных ооцитов свиней в течение 44 часов с диметилглицеролатом кремния обеспечило повышение доли девитрифицированных ооцитов с высокоэкспандированным кумулюсом и улучшению показателей ядерного созревания. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о целесообразности использования ДМГК в концентрации 0,2 % в качестве криопротекторного агента в технологии витрификации женских гамет, а также его введения в состав сред для культивирования ооцитов Sus Scrofa Domesticus.
Благодарности (Acknowledgements)
Работа выполнена в соответствии с темой Министерства образования Российской Федерации, номер госрегистрации – АААА-А18-118021590132-9.
1. Амстиславский С. Я., Мокроусова В. И., Кожевникова В. В., Кизилова Е. А., Брусенцев Е. Ю. Криобанк генетических ресурсов кошачьих // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2017. Т. 21. № 5. С. 561-568. DOI:https://doi.org/10.18699/VJ17.27o.
2. Гахова Э. Н., Утешев В. К., Шишова Н. В., Ивличева Н. А., Каурова С. А., Крамарова Л. И., Мельникова Е. В. Роль генетических криобанков в сохранении редких и исчезающих видов // Вестник Тамбовского университета. 2017. Т. 22. № 5. С. 861-865. DOI: 10. 20310/1810-0198-2017-22-5-861-865.
3. Иолчиев Б. С., Абилов А. И., Таджиева А. В., Багиров В. А. Биологическая полноценность эпидидимального семени зубра (Bison bonasus L.) при криоконсервации и длительном хранении // Сельскохозяйственная биология. 2017. Т. 52. № 2. С. 282-290. DOI:https://doi.org/10.15389/agrobiology.2017.2.282rus.
4. Айбазов М. М., Мамонтова Т. В. Создание биоресурсных коллекций - необходимое условие сохранения и рационального использования генетических ресурсов животных // Сельскохозяйственный журнал. 2018. № 2 (11). С. 54-62. DOI:https://doi.org/10.25930/47pm-n875.
5. Кузьмина Т. И., Шейко И. П., Ганджа А. И., Стефанова В. Н. Витрификация ооцитов как способ сохранения генофонда животных // Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы: материалы II Международной научной конференции, посвященной 50-летию основания Института генетики и цитологии НАН Беларуси. Минск, 2015. С. 160-172.
6. Абакушина Е. В., Гельм Ю. В., Миценык А. С. Флуоресцентный микроскопический анализ жизнеспособности ооцитов млекопитающих после витрификации // Оптика и спектроскопия. 2019. Т. 126. Вып. 5. С. 611-613. DOI:https://doi.org/10.21883/OS.2019.05.47660.9-19.
7. Somfai T., et al. Optimization of cryoprotectant treatment for the vitrification of immature cumulus-enclosed porcine oocytes: comparison of sugars, combinations of permeating cryoprotectants and equilibration regimens // Journal Reproduction and Development. 2015. Vol. 18. No. 61 (6). Pp. 571-579.
8. Kamoshita M., et al. Successful vitrification of pronuclear-stage pig embryos with a novel cryoprotective agent, carboxylatedε-poly-L-lysine // Public Library of Science (PLoS). 2017. Pp. 1-12. DOI:https://doi.org/10.1371/journal.pone.0176711.
9. Бурнатова Е. Н., Щипачева О. В., Тузанкина И. А., Хонина Т. Г., Рябухин И. В., Григорьева Ю. В., Мальчиков А. И. Сравнительный эффект кремнийцинк содержащего глицерогидрогеля и тестируемых иммунотропных препаратов на модели гриппозной инфекции у мышей // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2016. № 31. C. 73-76.
10. Kuzmina T. I., Stanislavovich T. I., Kravtsov V. Yu. Cytoprotective effect of highly dispersed silica nanoparticles on the viability of granulosa from porcine follicles // Russian Journal of Developmental Biology. 2018. Vol. 49. No. 4S. Pp. 22-23.
11. Саркисян Н. Г., Ронь Г. И., Тузанкина И. А., Хонина Т. Г., Ларионов Л. П., Симбирцев А. С., Дроздова Л. И., Тимченко А. С. Морфологическая оценка эффективности использования фармакологических композиций на основе кремнийорганического глицерогидрогеля // Иммунология. 2017. Т. 38. № 2. С. 91-96. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-2-91-96.
12. Sanfilippo S., Canis M., Smitz J., et al. Vitrification of human ovarian tissue: a practical and relevant alternative to slow freezing // Reproductive Biology and Endocrinology. 2015. No. 13. Pp. 67. DOIhttps://doi.org/10.1186/s12958-015-0065-5.
13. Mouttham L., et al. Damage to fetal bovine ovarian tissue caused by cryoprotectant exposure and vitrification is mitigatedduring tissue culture // Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 2015. Vol. 32. No. 8. Pp. 1239-1250.
14. Suzuki N., Yoshioka N., Takae S., Sugishita Y., Tamura M., Hashimoto S. et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency // Human Reproduction. 2015. Vol. 30. No. 3.Pp. 608-615. DOIhttps://doi.org/10.1093/humrep/deu353.
15. Станиславович Т. И., Кузьмина Т. И., Молчанов А. В. Влияние интраовариальной витрификации на показатели криорезистентности ооцит-кумулюсных комплексов свиней // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. 2019. № 4. С. 65-70. DOI:https://doi.org/10.17238/issn2072-6023.2019.4.
16. Macaulay D. Angus, et al. Cumulus cell transcripts transit to the bovine oocyte in preparation for maturation // Biology of reproduction. 2016. Vol. 94. No. 1 (16). Pp. 1-11.
