Аннотация. Цель исследования – оценка генетического полиморфизма казахстанских популяций редких реликтовых и эндемичных видов Allium. Новизна исследований заключается в использовании современного молекулярно-генетического iPBS (Inter-Primer Binding Site Polymorphism) метода амплификации ДНК, для оценки генетического разнообразия различных популяций Allium, собранных в местах их естественного произрастания на территории Казахстанского Алтая. Методы. В качестве объектов исследований были использованы лекарственные реликтовые и исчезающие виды лука (A. ledebourianum, A. altaicum, A. microdiction), собранные в местах их естественного произрастания на территории Казахстанского Алтая. ДНК выделяли из 3–5-дневных стерильных проростков лука с использованием лизирующего СТАВ-буфера c РНКазой А. В работе использовали PBS-праймеры для оценки генетического разнообразия различных популяций Allium. Оценку результатов амплификации, полученных с использованием различных PBS-праймеров, проводили в программе-макросе GenAlex 6.5 для Excel. Результаты. Проведен анализ полиморфизма 16 генотипов редких реликтовых и исчезающих видов Allium с использованием 7 PBS-праймеров. Были получены четко различимые ампликоны, количество которых варьировало в зависимости от используемого праймера. Дендрограмма, основанная на анализе UPGMA, сгруппировала изучаемые генотипы в 2 основных кластера, в один из которых вошли образцы популяции A. altaicum, во второй кластер вошли образцы A. ledebourianum. A. microdictyon, представленный одним образцом, не вошел ни в один кластер, в дендрограмме сформировал базальную ветвь. В результате исследований была выявлена высокая степень iPBS-полиморфизма и генетического разнообразия редких реликтовых и исчезающих видов Allium. Практическая значимость. Использование молекулярно-генетического iPBS-метода позволяет выявить высокий уровень полиморфизма, который может служить основой для идентификации различных генотипов вида Allium, что позволит существенно дополнить традиционные методы сохранения естественных популяций данного рода.
Allium, популяция, ПЦР, молекулярные маркеры, iPBS, генотип, амплификация, кластерный анализ.
Постановка проблемы (Introduction)
На сегодняшний день сохранение биологического разнообразия – одна из важнейших проблем современного мира. Основой биологического разнообразия являются его генетические ресурсы. Сокращение или исчезновение видового и генетического разнообразия представляет угрозу для воспроизводства природных экосистем. Редкие и исчезающие виды растений имеют меньшее генетическое разнообразие, чем широко распространенные, и поэтому они более подвержены угрозе исчезновения при изменении условий окружающей среды и антропогенного фактора [1, с. 1], [2, с. 223]. Изучение генетического разнообразия редких и исчезающих видов растений: внутрипопуляционного полиморфизма, генетической дифференциации популяций – в комплексе с изучением морфологии вида, биологических признаков популяции, особенностями возрастного спектра позволит наиболее точно изучить особенности редких видов растений, а значит, позволит выбрать наиболее рациональный механизм сохранения.
Применение существующих на сегодняшний день молекулярно-генетических методов исследований очень важно при выборе стратегии сохранения редких реликтовых и исчезающих видов растений, так как данные методы позволяют выявить генетическую структуру вида растений, генетическое разнообразие в популяциях и между ними, а также создать «генетические паспорта» для охраняемых видов растений с целью поддержания и сохранения биоразнообразия.
Представители рода Allium L. (лук) – это многолетние травянистые растения, относящиеся к подсемейству луковых (Alliaceae), семейству амариллисовых (Amaryllidaceae). Практически все виды луков являются ценными пищевыми, лекарственными или декоративными растениями, издавна заготавливаемыми человеком, что приводит к значительному истощению запасов в природе. Род Allium L. представлен 750–800 видами. Это один из крупнейших родов флоры Казахстана, который включает в себя 140 видов, 21 вид из которых встречается на территории Казахстанского Алтая, Сауро-Манрака и Зайсанской котловины [3], [4, с. 279], [5, с. 3].
Среди луков довольно много редких видов, которые представляют научный интерес и являются объектами изучения с целью сохранения их биоразнообразия, а также нуждаются в экстренных охранных действиях. Одними из них являются представители рода Allium: A. altaicum, A. ledebouriamum, A. microdiction, A. schoenoprasum, A. obliquum, A. microdiction. Это реликтовые растения ледникового периода, которые повсеместно сокращают свою численность из-за массового сбора для пищевого назначения. В связи с изменением среды обитания под влиянием хозяйственной деятельности человека происходит сокращение природных местонахождений луков. Бесконтрольные массовые заготовки уничтожают маточные растения, что значительно сокращает семенное возобновление этих видов и приводит к снижению их численности и ареалов распространения. В настоящее время эти виды встречаются только на труднодоступных склонах, популяции носят спорадический характер, а часть из них представлена несколькими особями. Некоторые представители рода Allium ввиду их высокой биологической ценности занесены в Красную книгу нескольких государств: Монголии, России, Китая. В Казахстане данные виды луковых растений являются редкими, узколокальными эндемиками. Стратегия сохранения и размножения их численности является весьма актуальной задачей в сохранении биоразнообразия природной флоры Казахстана.
Решать проблемы исчезновения данных видов в местах их природного местобитания необходимо с применением новых современных подходов и инструментов для сохранения биоразнообразия.
На сегодняшний день существует огромное количество методов исследования ДНК. В настоящий момент представители рода Allium изучаются с использованием различных молекулярных маркеров, таких как RAPD, ISSR, AFLP, SSR. Кроме того, секвенирован пластидный геном лука репчатого A. cepa. Изучена филогения дикорастущих видов Allium с помощью последовательностей ITS и EST [6, с. 260], [7, с. 560], [8, с. 19]. В отличие от вышеупомянутых методов, iPBS-амплификацию ДНК начали использовать относительно недавно. Данный метод заключается в использовании консервативных областей последовательностей PBS сайтов ретротранспозонов как для выявления полиморфизма в профилях транскрипции и клонирования LTR сегментов из геномной ДНК, так и для поиска в базах данных ретротранспозонов. Ввиду того что многие ретротранспозоны являются встроенными в другие ретротранспозоны и инвертированы друг к другу или фрагментированы, они могут быть доступны при использовании консервативных PBS-праймеров в амплификации ДНК для любого вида растений или животного [9, с. 14], [10], [11, с. 923], [12, с. 460]. Это позволяет использовать данный метод в качестве универсального и высокоэффективного метода для прямой детекции полиморфизма. Изучение полиморфизма как генома в целом, так и отдельных генов представляет несомненный научный и практический интерес [13, с. 3].
Таким образом, оценка генетического разнообразия различных популяций Allium, собранных в местах их естественного произрастания на территории Казахстанского Алтая с использованием современного молекулярно-генетического iPBS-метода амплификации ДНК, является актуальной задачей и обусловливает выбор направления исследований для сохранения и воспроизводства биологического разнообразия Казахстана. Использование этого метода позволяет выявить высокий уровень полиморфизма, который может служить основой для идентификации различных генотипов рода Allium, что позволит существенно дополнить традиционные методы сохранения естественных популяций данного рода [14, с. 77], [15, с. 1157].
Методология и методы исследования (Methods)
В качестве объектов исследований были использованы лекарственные, редкие реликтовые и исчезающие виды лука (A. altaicum – 12 образцов, A. ledebourianum – 3 образца, A. microdictyon – 1 образец), собранные в местах их естественного произрастания на территории Казахстанского Алтая. Сроки сбора образцов были привязаны к температурному режиму и сходу снегового покрова. Координаты и абсолютная высота местонахождения ценопопуляций, из которых был взят растительный материал, были определены с помощью GPS-навигатора. Места произрастания популяций показаны на рис. 1. Характеристика собранных образцов Allium представлена в таблице 1.
Рис. 1. Места сбора образцов редких реликтовых и эндемичных видов лука на территории Казахстанского Алтая
Fig. 1. Places of collection of samples of rare relict and endemic species of Allium in the territory of Kazakhstan Altai
Таблица 1
Характеристика образцов Allium на территории Казахстанского Алтая
|
Наименование вида |
Место сбора |
Координаты |
Высота, м над ур. м. |
ID номер |
|
|
Широта |
Долгота |
||||
|
A. altaicum |
Южный Алтай, хребет Тарбагатай, перевал Бурхат |
49°07'33"
|
86°02'10" |
2146 |
Al 1 |
|
Хребет Калбинский (Восточная Калба), горы Коктау |
49°29'37"
|
82°36ʼ19" |
693 |
Al 2 |
|
|
Хребет Калбинский, урочище Талды, горы Коктау, северо-западный склон |
49º29'11'
|
82º35'37" |
707 |
Al 8 |
|
|
Западный Алтай, хребет Убинский, юго-восточный склон, гора Порожная |
50º33'33"
|
82º32'46" |
1800 |
Al 9 |
|
|
Южный Алтай, хребет Тарбагатай, северо-западный склон, в районе перевала Бурхат |
50°33'32"
|
81°39'30" |
786 |
Al 10 |
|
|
Хребет Нарымский, урочище Кедровый Ключ, юго-западный склон |
48º54'34"
|
83º44'21" |
1200 |
Al 11 |
|
|
Участок природной флоры Алтайского ботанического сада |
50º19'34'
|
83º32'46" |
774 |
Al 12 |
|
|
Хребет Сарым-Сакты, юго-восточный щебнистый склон, Бурхат |
49º07'33"
|
86º02'10" |
2146 |
Al 13 |
|
|
Хребет Ивановский, урочище Серый Луг, северо-западный склон |
50º19'16"
|
83º52'51" |
1800 |
Al 14 |
|
|
Калбинский Алтай, окрестности озер Сибинских |
49°24'5" |
82°58'23" |
987 |
Al 15 |
|
|
Хребет Западная Листвяга, юго-восточный склон, долина реки Кондрашка |
49°23'16" |
85°45'18" |
1585 |
Al 16 |
|
|
Хребет Калбинский, урочище Талды, горы Коктау, юго-восточный склон |
49º29'18'
|
82º35'44" |
915 |
Al 17 |
|
|
A. ledebouriamum |
Южная часть хребта Линейский |
50°19'12" |
84°11'49" |
1925 |
Al 6 |
|
Хребет Ивановский, ущелье Серый Луг |
50°21'27"
|
83°53'54" |
1170 |
Al 20 |
|
|
Юго-Западный Алтай, Проходной белок |
49°07'33"
|
83°32'44" |
774 |
Al 3 |
|
|
A. microdiction |
Хребет Ивановский, Пихтовый лес, ущелье Серый Луг |
50º20'33' |
83º44'04" |
1023 |
Al 21 |
Table 1
Characteristics of the Allium samples collected in the territory of Kazakhstan Altai
|
Type name |
Collection place |
Coordinates |
Altitude, m above sea |
ID |
|
|
Latitude |
Longitude |
||||
|
A. altaicum |
South Altai Tarbagatai range, Burkhat passage |
49°07'33"
|
86°02'10" |
2146 |
Al 1 |
|
Kalba Range (Eastern Kalba), Koktau Mountains |
49°29'37"
|
82°36ʼ19" |
693 |
Al 2 |
|
|
Kalba Range, Taldy Ecosite, Koktau Mountain, North-west slope |
49º29'11'
|
82º35'37" |
707 |
Al 8 |
|
|
Ubinskiy Range, South-eastern slope, Porozhnaya Mountain |
50º33'33"
|
82º32'46" |
1800 |
Al 9 |
|
|
South Altai Tarbagatai, North-west slope, in the area of the Burkhat passage |
50°33'32"
|
81°39'30" |
786 |
Al 10 |
|
|
Narymskiy Range, Kedrovyy Kliuch Ecosite, South-west slope |
48º54'34"
|
83º44'21" |
1200 |
Al 11 |
|
|
Site of natural flora of the Altai Botanical Garden |
50º19'34'
|
83º32'46" |
774 |
Al 12 |
|
|
Sarym-Sakty Range, South-east rubble slope, Burkhat |
49º07'33"
|
86º02'10" |
2146 |
Al 13 |
|
|
Ivanovskiy Range, Seryy Lug Ecosite, North-west slope |
50º19'16"
|
83º52'51" |
1800 |
Al 14 |
|
|
Kalbinskii Altai, Sibin Lakes vicinities |
49°24'5" |
82°58'23" |
987 |
Al 15 |
|
|
Western Listvyaga Range, south-east slope, valley of the Kondrashka River |
49°23'16" |
85°45'18" |
1585 |
Al 16 |
|
|
Kalba Range, Taldy Ecosite, Koktau Mountain, South-east slope |
49º29'18'
|
82º35'44" |
915 |
Al 17 |
|
|
A. ledebouriamum |
Lineyskiy Range, South Altai |
50°19'12" |
84°11'49" |
1925 |
Al 6 |
|
Ivanovsky Range, Seriy Lug Ecosite, |
50°21'27"
|
83°53'54" |
1170 |
Al 20 |
|
|
Southwestern Altai, Prokhodnoy belok |
49°07'33"
|
83°32'44" |
774 |
Al 3 |
|
|
A. microdiction |
Ivanovsky Range, fir forest, Seriy Lug Ecosite |
50º20'33'
|
83º44'04" |
1023 |
Al 21 |
ДНК выделяли из 3–5-дневных стерильных проростков лука с использованием кислого лизирующего СТАВ-буфера c РНКазой А. Экстрагированную ДНК растворяли в 100 мкл 1 × ТЕ-буфера (1 мМ ЭДТА, 10 мМ Tris-HCl, pH 8,0). Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрическим методом с использованием спектрофотометра NanoDrop1000 (Thermo Scientific).
Визуализацию экстрагированной ДНК проводили в 1-процентном агарозном геле с использованием гельдокументирующей системы ChemiDoc-It2. Образцы ДНК были подготовлены в двух вариантах: маточный раствор для длительного хранения при температуре –20 °С; рабочие растворы, используемые для ПЦР в концентрации 10 нг/мкл.
В работе использовали PBS-праймеры для оценки генетического разнообразия различных популяций Allium. Нуклеотидные последовательности этих PBS-участков универсальны для всех ретротранспозонов и относятся к высокоповторяющимся последовательностям, характерным для высших эукариот. Последовательности используемых праймеров, комплементарных участкам различных ретротранспозонов, представлены в таблице 2.
Таблица 2
Последовательности используемых в работе 18-мерных PBS праймеров
|
ID |
Последовательность 5’–3’ |
Температура отжига (°С) |
ГЦ-состав (%) |
|
2221 |
ACCTAGCTCACGATGCCA |
56,9 |
55,6 |
|
2237 |
CCCCTACCTGGCGTGCCA |
55,0 |
72,2 |
|
2240 |
AACCTGGCTCAGATGCCA |
55,0 |
55,6 |
|
2249 |
AACCGACCTCTGATACCA |
51,0 |
50,0 |
|
2257 |
CTCTCAATGAAAGCACCA |
50,0 |
44,4 |
|
2373 |
GAACTTGCTCCGATGCCA |
51,0 |
55,6 |
|
2395 |
TCCCCAGCGGAGTCGCCA |
52,8 |
72,2 |
Table 2
Sequences of 18-mer PBS primers used in this study
|
ID |
Sequence 5’–3’ |
Annealing temperature (°С) |
GC (%) |
|
2221 |
ACCTAGCTCACGATGCCA |
56.9 |
55.6 |
|
2237 |
CCCCTACCTGGCGTGCCA |
55.0 |
72.2 |
|
2240 |
AACCTGGCTCAGATGCCA |
55.0 |
55.6 |
|
2249 |
AACCGACCTCTGATACCA |
51.0 |
50.0 |
|
2257 |
CTCTCAATGAAAGCACCA |
50.0 |
44.4 |
|
2373 |
GAACTTGCTCCGATGCCA |
51.0 |
55.6 |
|
2395 |
TCCCCAGCGGAGTCGCCA |
52.8 |
72.2 |
Реакцию ПЦР проводили в объеме 20 мкл реакционной смеси, включающей 3 мкл ДНК (10 нг/мкл), 4 мкл Phire Reaction Buffer 5х с MgCl 2, 1 мкл праймера (10 мМ), 0,4 мкл смеси dNTPs (10 мМ), 0,2 мкл 1 U Phire Hot Start полимеразы. Режим амплификации был следующим: предварительная денатурация при 98 °С в течение 2 минут, затем 30 циклов: 98 °С – 30 с, 50–57 °С – 1 минута с, 72 °С – 1 минута, дополнительная элонгация при 72 °С – 2 минуты. Амплификацию проводили в амплификаторе T100 Thermal Cycler (BIO RAD). Полученные продукты амплификации (ампликоны) визуализировали в 1,5-процентном агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Размеры амплифицируемых фрагментов ДНК определяли путем сопоставления их с маркером (Thermo Scientific GeneRuler DNA Ladder Mix 100-10,000 bp). Определение длин фрагментов проводили с использованием программы Quantity One в системе гель-документации ChemiDoc-It®TS2 Imager (UVP). Уровень детектируемого полиморфизма определяли процентным отношением полиморфных ампликонов к общему числу ампликонов для каждого праймера.
Оценку результатов амплификации, полученных с использованием различных PBS-праймеров, проводили в программе-макросе GenAlex 6.5 для Exel с определением информативных параметров, таких как индекс информативности праймера (PIC), разнообразие аллелей (Nа), эффективное число аллелей (Ne), информационный индекс Шеннона (I), ожидаемая гетерозиготность (Не), наблюдаемая гетерозиготность (uНe), общее число локусов (L) [16, с. 174].
Была составлена бинарная матрица, в которой наличие фрагмента обозначалось как 1, отсутствие – как 0. Затем по результатам данной матрицы с использованием программы Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA-Х) была выполнена кластеризация методом невзвешенного парно-группового усреднения (UPGMA) [17, с. 288].
Результаты (Results)
На хребтах Казахстанского Алтая в зависимости от увлажнения почвы и места произрастания выделено несколько групп ценопопуляций изучаемых видов лука A. altaicum, A. ledebourianum, A. microdictyon на территории юго-западной периферии Западного и Южного Алтая.
Лук Ледебура (A. ledebourianum) – узколокальный эндемик, гигрофит, светолюбивый обитатель мест повышенного увлажнения. В Казахстане лук Ледебура произрастает на хребтах юго-западной и юго-восточной периферии Западного Алтая (Ивановский, Ульбинский, Убинский, Линейский, Коксинский, Холзун, Листвяга), горно-лесной части хребтов Южного Алтая (Курчумский, Южный Алтай, Сарымсакты, Южноалтайский Тарбагатай) и юго-восточной периферии Центрального Алтая (Чиндогатуйские горы). Наиболее типичные места обитания: берега рек, ручьев, кочкарниковые болота, чрезмерно сырые луга, микропонижения, где скапливается значительное количество влаги в течение всего вегетационного периода.
Лук мелкосетчатый (A. microdictyon) – мезофит, мезогигрофит, обитающий в горно-лесных и луговых сообществах. В Казахстане лук мелкосетчатый произрастает только на хребтах казахстанского Алтая (Холзун, Ивановский, Линейский, Убинский), обрамляющих Риддерскую впадину. В Казахстанском Алтае лук мелкосетчатый находится на юго-западной периферии ареала. Ценопопуляции встречаются по северо-западным и северо-восточным склонам хребтов на тяжелых, уплотненных, суглинистых почвах, умеренно или избыточно увлажненных.
Лук алтайский (A. altaicum) – редкое растение, ледниковый реликт. В Казахстане лук алтайский произрастает на территории юго-западной периферии Западного Алтая, на хребтах Ивановский, Ульбинский, Убинский и Листвяга. Выделены популяции в Южном Алтае на хребтах Южный Алтай и Тарбагатай. Давольно часто встечается в Восточном Казахстане на хребтах Калбинский, Нарымский, Сарымсакты, Ульбинский и на плоскогорье Укок [18, с. 104] (рис. 2).
а) б)
a) b)
Рис. 2. Внешний вид растений лука:
а) лук мелкосетчатый (A. microdictyon)
б) лук алтайский (A. altaicum)
Fig. 2. Appearance of plants:
a) plants of A. microdictyon
b) plants of A. altaicum
В результате амплификации были получены четко различимые ампликоны, количество которых варьировало в зависимости от используемого праймера. Детектируемый полиморфизм и насыщение спектров амплификации являлись критериями эффективности используемых праймеров.
В результате iPBS-анализа 16 генотипов редких реликтовых и исчезающих видов Allium было амплифицировано 165 фрагментов (таблица 3). Количество информативных амплифицируемых фрагментов в зависимости от праймера колебалось от 15 до 35, их размеры варьировали от 100 до 1500 п. н. Уровень полиморфизма для всех образцов коллекции составлял от 74 % до 100 %, что является достаточным для дифференциации исследуемых генотипов. Изучаемые образцы отличались индивидуальным сочетанием полиморфных амплифицированных фрагментов различного молекулярного веса.
Таблица 3
Анализ продуктов амплификации ДНК Allium c PBS-праймерами
|
ID |
Амплифицированные фрагменты |
Полиморфизм, % |
|
|
Всего |
Полиморфных |
||
|
2221 |
39 |
35 |
90 |
|
2237 |
23 |
21 |
91 |
|
2240 |
25 |
23 |
92 |
|
2249 |
23 |
17 |
74 |
|
2257 |
15 |
15 |
100 |
|
2373 |
20 |
19 |
95 |
|
2395 |
20 |
20 |
100 |
|
Всего |
165 |
150 |
– |
|
Среднее |
23.6 |
21,4 |
91,7 |
Table 3
Analysis of the Allium DNA amplification products with PBS primers
|
ID |
Amplified fragments |
Polymorphism, % |
|
|
Total |
Polymorphic |
||
|
2221 |
39 |
35 |
90 |
|
2237 |
23 |
21 |
91 |
|
2240 |
25 |
23 |
92 |
|
2249 |
23 |
17 |
74 |
|
2257 |
15 |
15 |
100 |
|
2373 |
20 |
19 |
95 |
|
2395 |
20 |
20 |
100 |
|
Total |
165 |
150 |
– |
|
Average value |
23.6 |
21.4 |
91.7 |
В результате проведения ПЦР с 7 PBS-праймерами получено 486 локусов (таблица 4). На основе этих данных рассчитаны основные показатели генетического полиморфизма, отражающие уровень изменчивости в исследуемых популяциях Allium. Индексы полиморфизма при использовании PBS-праймеров варьировали от 0,689 для праймера 2257 до 0,831 для праймера 2373 со средним значением 0,761. В результате проведенных исследований все изучаемые праймеры показали значения выше 0,5, что говорит об эффективности их использования при изучении генетического полиморфизма Allium. Информационный индекс Шеннона (I), который показывает среднюю минимальную длину уникального бинарного таксономического кода одной структурной единицы из анализируемой коллекции или выборки, варьировал от 0,271 до 0,310. Чем меньше значение I, тем стабильнее популяция, чем больше данное значение, тем больше видовое разнообразие. В ходе изучения генетического разнообразия популяций Allium с использованием PBS-праймеров установлено, что наблюдаемая гетерозиготность (uНе) всех популяций больше ожидаемой гетерозиготности (Не), что говорит о том, что система случайного скрещивания в популяции преобладает над имбридингом.
Таблица 4
Оценка информативности PBS-праймеров по основным показателям генетического полиморфизма
|
Праймер |
L |
PIC |
Nа |
Ne |
I |
Не |
uНе |
|
2221 |
117 |
0,719 |
1,291 |
1,373 |
0,310 |
0,213 |
0,243 |
|
2237 |
69 |
0,794 |
1,203 |
1,330 |
0,286 |
0,194 |
0,221 |
|
2240 |
75 |
0,779 |
1,240 |
1,335 |
0,290 |
0,196 |
0,225 |
|
2249 |
69 |
0,746 |
1,290 |
1,363 |
0,309 |
0,211 |
0,243 |
|
2257 |
48 |
0,689 |
1,313 |
1,342 |
0,295 |
0,201 |
0,229 |
|
2373 |
48 |
0,831 |
1,146 |
1,308 |
0,271 |
0,183 |
0,208 |
|
2395 |
60 |
0,769 |
1,250 |
1,320 |
0,286 |
0,192 |
0,220 |
|
|
Всего 486 |
Среднее 0,761 |
|
|
Среднее 0,292 |
|
|
Table 4
Evaluation of the informative value of PBS primers by the main indicators of genetic polymorphism
|
Primer |
L |
PIC |
Nа |
Ne |
I |
Не |
uНе |
|
2221 |
117 |
0.719 |
1.291 |
1.373 |
0.310 |
0.213 |
0.243 |
|
2237 |
69 |
0.794 |
1.203 |
1.330 |
0.286 |
0.194 |
0.221 |
|
2240 |
75 |
0.779 |
1.240 |
1.335 |
0.290 |
0.196 |
0.225 |
|
2249 |
69 |
0.746 |
1.290 |
1.363 |
0.309 |
0.211 |
0.243 |
|
2257 |
48 |
0.689 |
1.313 |
1.342 |
0.295 |
0,201 |
0.229 |
|
2373 |
48 |
0.831 |
1.146 |
1.308 |
0.271 |
0.183 |
0.208 |
|
2395 |
60 |
0.769 |
1.250 |
1.320 |
0.286 |
0.192 |
0.220 |
|
|
Total 486 |
Average value 0.761 |
|
|
Average value 0.292 |
|
|
Данные, полученные в результате амплификации с PBS-праймерами различных популяций Allium, были использованы для кластерного анализа и построения UPMGA-дендрограммы. A. microdictyon, представленный одним образцом, не вошел ни в один кластер, в дендрограмме сформировал базальную ветвь. Все остальные анализируемые образцы казахстанских популяций Allium формируют два кластера (рис. 3). В первый кластер вошли образцы популяции A. altaicum, во второй кластер вошли образцы A. ledebourianum.
Рис. 3. Дендрограмма генетических различий 16 образцов Allium с использованием PBS-праймеров
Fig. 3. Dendrogram of genetic differences of 16 Allium samples using PBS primers
Обсуждение и выводы (Discussion and Conclusion)
Лимитирующими факторами широкого распространения изучаемых видов Allium являются их слабая способность формировать дочерние луковицы и низкая семенная продуктивность, которая обусловлена стрессовыми факторами среды – сухим жарким летом и холодной снежной зимой. В природных местообитаниях прорастание семян идет растянуто и может занять даже несколько лет [19, с. 125]. На продуктивность оказывает влияние также густой растительный покров, не позволяющий размножаться вегетативным способом, и массовый неконтролируемый сбор населением.
В течение последних десятилетий использование молекулярных методов исследований, выявляющих полиморфизм на уровне ДНК, играет немаловажную роль в улучшении и сохранении природного биоразнообразия редких реликтовых и исчезающих видов растений. В результате изучения литературных данных установлено, что ранее исследования по генетическому разнообразию для видов A. microdictyon, A. altaicum, A. ledebourianum с использованием PBS-праймеров не проводились. В качестве исходной задачи предполагалось использование PBS-праймеров для выявления полиморфизма и генотипирования изучаемых образцов. Для проведения PBS-амплификации использовали праймеры, разработанные ранее Kalendar R., et al. [20, p. 1419]. Длина PBS-участков ретротранспозонов, на которые были ориентированы в обоих направлениях праймеры, не превышает 18 нуклеотидов.
Исследования популяций вида Allium с использованием PBS-праймеров показали высокий уровень полиморфизма и генетического разнообразия. Индекс полиморфизма (PIC) является важным показателем, который оценивает эффективность полиморфных локусов и определяет эффективность каждого праймера. По классификации Botstein, et al. (1980), к высокоинформативным праймерам относятся те, у которых PIC ≥ 0,5, к среднеинформативным – имеющие значение PIC в интервале 0,5–0,25; к низкоинформативным – при PIC ≤ 0,25 [21, с. 314]. Индексы полиморфизма при использовании PBS-праймеров варьировали от 0,689 до 0,831 со средним значением 0,761, что говорит о высокоинформативности и эффективности их использования при изучении генетического полиморфизма Allium. Существуют работы по анализу генетического разнообразия лука (Allium cepa L. и A. regelianum) с использованием специфических маркеров RAPD и ISSR. В этих работах значение PIC находилось в пределах 0,07–0,5 по изучаемым генотипам для RAPD-маркеров. Значения PIC – от 0,06 до 0,26 для ISSR-маркеров по тем же генотипам [22, с. 110], [23, с. 30], [24, с. 213].
В работах по генетическому разнообразию популяций фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris L.) на основе ретротранспозонов (iPBS) находят подтверждение наши исследования о высокоинформативности и эффективности применения PBS праймеров. Авторы использовали те же 18-нуклеотидные праймеры (2221, 2237, 2249, 2395), что и мы в наших исследованиях. Значение PIC для этих праймеров было выше 0,5 и варьировало от 0,54 до 0,91. Это подтверждает, что PIC является важным показателем, который оценивает полезность и эффективность полиморфных локусов и определяет высокую различающую способность праймеров среди изучаемых образцов [25, с. 940].
В работе Phong, et al. (2016) по разнообразию чая (Camellia sinensis), выращенного во Вьетнаме, авторы использовали 6 PBS-праймеров, один из них – 2373 – встречается в нашей работе. Процент полиморфизма образцов чая с использованием PBS-праймера 2373 в данном исследовании составил 88,89 %. В результате наших исследований процент полиморфизма данного праймера составил 95 % [26, с. 385].
Эффективность iPBS-метода оценивали при изучении генетической изменчивости между популяциями вида Allium. Оценку праймеров проводили по информационному индексу Шеннона и ожидаемой гетерозиготности. По двум этим параметрам самые высокие значения наблюдали у праймера 2221 (I = 0.310; Не = 0.213), тогда как самые низкие показатели были у праймера 2373 (I = 0.271; Не = 0.183). В работе Koc J., et al. (2018) при изучении генетической изменчивости Colobanthus quitensis с использованием iPBS-метода также представлены результаты об информативности индекса Шеннона и ожидаемой гегетрозиготности. Полученные авторами данные подтверждают информативность, надежность и эффективность использования PBS-праймеров для изучения генетического разнообразия растений [27, с. 2467].
В результате исследований было выявлено, что нет связи между генетическим разнообразием и географическим происхождением образцов Allium, так как экотипы одного вида с разным географическим происхождением были сгруппированы каждый в отдельный кластер. Так, например, вид A. altaicum сформировал отдельный кластер, в который вошли 12 экотипов из Западного и Южного Алтая, а также с участка природной флоры Алтайского ботанического сада. Вид A. ledebourianum также был сформирован в отдельный кластер, в который вошли экотипы из Западного, Юго-Западного Алтая.
В результате проведенных работ была сформирована коллекция PBS-праймеров, информативных для анализа исследуемых образцов, с их использованием была выявлена высокая степень полиморфизма и генетического разнообразия. Результаты исследования показали, что PBS-праймеры могут быть использованы для оценки генетического разнообразия как на межвидовом, так и на внутривидовом уровне, так как являются надежными и высокоинформативными. Использование iPBS-метода позволит решить проблему видовой идентификации редких исчезающих видов Allium, а также сохранениия их биологического разнообразия.
Благодарности (Acknowledgements)
Работа поддержана Министерством образования и науки Республики Казахстан в рамках программы финансирования исследований по проекту АР 05130404.
1. Vincent H., Bornand C. N., Kempel A., Fischer M. Rare species perform worse than widespread species under changed climate // Biological Conservation. 2020. No. 246. DOI:https://doi.org/10.1016/j.biocon.2020.108586.
2. Трифонова А. А. Генетическое разнообразие в популяциях особо охраняемых видов растений Волгоградской области: дис. … канд. биол. наук. М., 2018. 223 с.
3. Список видов рода лук (Allium) [Электронный ресурс] // The Plant List. URL: http://www.theplantlist.org/1.1/browse/A/Amaryllidaceae/Allium (дата обращения: 02.07.2020).
4. Байтенов М. С. Флора Казахстана. Т. 2. Алматы: Гылым, 2001. 279 с.
5. Котухов Ю. А., Данилова А. Н., Ануфриева О. А. Конспекты луков (Allium L.) Казахстанского Алтая, Сауро-Манрака и Зайсанской котловины // Ботанические исследования Сибири и Казахстана. 2011. № 17. С. 3-33.
6. Chen S., Chen W., Shen X., Yang Y., Qi F., Liu Y., Meng H. Analysis of the genetic diversity of garlic (Allium sativum L.) by simple sequence repeat and inter simple sequence repeat analysis and agro-morphological traits // Biochemical Systematics and Ecology. 2014. Vol. 55. Pp. 260-267.
7. Филюшин М. А. AFLP маркирование генотипов сортов лука-порея (Allium porrum) // Генетика. 2011. Т. 47. № 4. С. 560-565.
8. Филюшин М. А. Анализ полиморфизма генома чеснока Allium sativum и родственных видов секции Allium: автореф. дис. … канд. биол. наук. М., 2017. 19 с.
9. Galindo-González L., Mhiri C., Deyholos M. K., Grandbastien M. LTR-retrotransposons in plants: Engines of evolution // Gene. 2017. Vol. 626. Pp. 14-25. DOI:https://doi.org/10.1016/j.gene.2017.04.051.
10. Li S., Ramakrishnan M., Vinod K. K., Kalendar R., Yrjälä K., Zhou M. Development and Deployment of High-Throughput Retrotransposon-Based Markers Reveal Genetic Diversity and Population Structure of Asian Bamboo // Forests. 2019. Vol. 11 (1). No. 31. Pp. 1-25. DOI:https://doi.org/10.3390/f11010031.
11. Yilmaz S., Marakli S., Yuzbasioglu, G., Gozukirmizi N. Short-term mutagenicity test by using IRAP molecular marker in rice grown under herbicide treatment // Biotechnology & Biotechnological Equipment. 2018. Vol. 32. Pp. 923-928. DOI:https://doi.org/10.1080/13102818.2018.1474137.
12. Nie Q., Qiao G., Peng L., Wen X. Transcriptional activation of long terminal repeat retrotransposon sequences in the genome of pitaya under abiotic stress // Plant Physiology and Biochemistry. 2018. Vol. 135. Pp. 460-468 DOI:https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2018.11.014.
13. Khapilina O. N., Daniyarov A. Z., Аmenov А. А., Novakovskaya А. P., Тurzhanova А. S., Тagimanova D. S., Filippova N. I., Каlendar R. N. Analysis of genetic diversity in legumes germplasm using retrotransposon based molecular markers // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. 2017. No. 2. Pp. 3-11. DOI:https://doi.org/10.11134/btp.2.2017.4.
14. Abdou R., Bakasso Y., Saadou M., Baudoin J. P., Hardy O. J. Genetic diversity of Niger onions (Allium cepa L.) assessed by simple sequence repeat markers (SSR) // Acta Horticulturae 1143, VII International Symposium on Edible Alliaceae. Nigde (Turkey), 2015. Pp. 77-90.
15. Nguyen N. H., Driscoll H. E., Specht C. D. A molecular phylogeny of the wild onions (Allium; Alliaceae) with a focus on the western North American center of diversity // Molecular Phylogenetics and Evolution. 2008. Vol. 47 (3). Pp. 1157-1172.
16. Валуйских О. Е., Шадрин Д. М., Пылина Я. И. Морфологическая изменчивость и генетическое разнообразие популяций Gymnadenia conopsea (L.) R. Br. (Orchidaceae) на европейском северо-востоке России (Республика Коми) // Генетика. 2019. Т. 55. № 2. С. 174-191.
17. Peakall R., Smouse P.E. Genalex 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research // Molecular Ecology Notes. 2006. Vol. 6. No. 1. Pp. 288-295. DOI:https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts460.
18. Данилова А. Н., Котухов Ю.А. Эколого-биологические особенности лука алтайского (Allium Altaicum Pall.) в природных условиях юго-западной периферии Западного Алтая // Вестник Национальной академии наук Республики Казахстан. 2006. № 2. С. 104-107.
19. Николаева М. Г. Покой семян // В книге «Физиология семян». М.: Наука, 1982. С. 125-183.
20. Kalendar R., Antonius K., Smýkal P., Schulman A. H. iPBS: a universal method for DNA Wngerprinting and retrotransposon isolation // Theoretical and Applied Genetics. 2010. Vol. 121. Рp. 1419-1430. DOI:https://doi.org/10.1007/s00122-010-1398-2.
21. Botstein D. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms // American Journal Human Genetics. 1980. Vol. 32. Pp. 314-331.
22. Sai Sudha G., Ramesh P., Chandra Sekhar A., Sai Krishna T., Bramhachari P.V., Riazunnisa K. Genetic diversity analysis of selected Onion (Allium cepa L.) germplasm using specific RAPD and ISSR polymorphism markers //Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 2019. Vol. 17. Pp. 110-118. DOI:https://doi.org/10.1016/j.bcab.2018.11.007.
23. Трифонова А. А., Кочиева Е. З., Кудрявцев А. М. Низкий уровень подразделенности популяций редкого вида Allium regellianum A. K. Becker ex Iljin Волгоградской области на основе данных ISSR-анализа // Экологическая генетика. 2017. Т. 15. № 1. C. 30-37. DOI:https://doi.org/10.17816/ecogen15130-37.
24. Trifonova A. A., Kochieva E. Z., Kudryavtsev A. M. Analysis of microsatellite loci variability in rare and endemic species Allium regelianum A. K. Becker ex Iljin // Russian Journal of Genetics. 2017. Vol. 53 (2). Pp. 213-220. DOI:https://doi.org/10.1134/S1022795417010124.
25. Nemli S., Kianoosh T., Tanyolac M. B. Genetic diversity and population structure of common bean (Phaseolus vulgaris L.) accessions through retrotransposon-based interprimer binding sites (iPBSs) markers // Turkish Journal of Agriculture and Forestry. 2015. Vol. 39. Pp. 940-948. DOI:https://doi.org/10.3906/tar-1505-59.
26. Phong N. H., Pongnak W., Soytong K., Poeaim S., Poeaim A. Diversity of Tea (Camellia sinensis) Grown in Vietnam based on Morphological Characteristics and Inter-primer Binding Sites (iPBS) Marker // International Journal of Agriculture & Biology. 2016. Vol.18. No. 2. Pp. 385-392. DOI:https://doi.org/10.17957/IJAB/15.0100.
27. Koc J., Androsiuk P., Chwedorzewska K., Cuba-Díaz M., Górecki R., Giełwanowska I. Range-wide pattern of genetic variation in Colobanthus quitensis // Polar Biology. 2018. Vol. 41. Рp. 2467-2479. DOI:https://doi.org/10.1007/s00300-018-2383-5.
